The virulence of Xanthomonas oryzae pv. oryzae regulated by the type Ⅲ effector XopG and the localization of XopG in plant cells

供试水稻TP309、本氏烟草（Nicotiana benthamiana）由本实验室保存，本实验所用的菌株和质粒如表1所示。

从KEGG数据库下载xopG基因CDs序列，使用Primer 5.0分别设计引物。本实验引物见表2。

根据KEGG （https://www.genome.jp/kegg/）网站查询到的XopG的基因序列，采用SMART在线网站（https://smart.embl.de/）进行XopG蛋白结构域分析；应用PSIPRED （http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）在线网站预测XopG蛋白二级结构；利用TMHMM （https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在线网站分析XopG有无跨膜结构域，基于SignalP （https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）在线网站预测XopG有无信号肽；通过在线网站NCBI （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和黄单胞菌数据库（https://www.xanthomonas.org/t3e.）获取10个XopG同源蛋白，采用MEGA11.0软件的NJ法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，通过DNAMAN 8.0进行蛋白多序列比对；通过比对基因上游500 bp的核酸序列，预测xopG启动子区是否具有PIP-box特征区。

利用同源重组的方法，敲除xopG和hrpX基因，详细实验步骤见参考文献^{[24 − 25]}。

应用酶切连接法构建pK18gusA-xopG表达载体^{[26 − 27]}，将pK18gusA-xopG分别转化野生型菌株T7174及ΔhrpX后，挑取单克隆进行GUS染色和GUS活力测定，以分析xopG表达情况，实验步骤如参考文献^{[28 − 29]}。

应用剪叶法^{[30 − 31]}进行水稻叶片接种实验，将T7174、xopG和C-ΔxopG菌株分别划线于PSA和PSSP （PSA+100 mg·L^-1 Sp）固体培养基上，28 ℃培养2 d后，用ddH₂O洗脱菌体，调至OD₆₀₀约为0.6。接种生长60 d左右的TP309水稻，每天观察水稻发病情况，14 d后记录病斑长度。

选择培养12 d左右的水稻黄化苗，取其茎秆切碎，参考酶解分离法进行水稻原生质体分离^{[32 − 33]}，获得水稻原生质体。运用PEG转化法^[34]将构建好的重组载体pRTVc-xopG-GFP转化到水稻原生质体中，培养12 h后于共聚焦显微镜下观察荧光。

将构建好的烟草定位载体pCambia-1300-xopG-eGFP转入农杆菌感受态GV3101中，于LB （含kana，Rif）液体培养基28 ℃培养16~18 h。培养好后，4 000 r·min⁻¹离心10 min，弃培养液，向管中加入2 mL农杆菌重悬Buffer，调至OD₆₀₀约为0.2，注射烟草叶片背面^[35]，保湿培养36 h于共聚焦显微镜下观察荧光。

xopG基因全长468 bp，预测编码155个氨基酸。采用SMART在线网站进行XopG蛋白结构域分析，发现XopG蛋白1-150位氨基酸存在典型的锌金属肽酶结构域，42-95位氨基酸存在SCOP结构域（图1−A），预测为典型锌金属肽酶。应用PSIPRED在线网站预测XopG蛋白二级结构，发现其有6处α-螺旋结构，2处β-折叠结构 （图1−B）。应用TMHMM在线网站分析发现XopG蛋白无跨膜结构（图1−C），可能为非膜定位蛋白。SignalP在线网站预测结果表明，XopG蛋白无信号肽（图1−D）。

Figure 1.  Bioinformatics analysis of XopG

为了研究XopG，我们从NCBI网站和黄单胞菌数据库中获得了与XopG （Xoo 4258）蛋白同源性较高的10条同源蛋白的序列数据（表3），并使用DNAMEN8.0软件对其同源蛋白进行多序列比对图2−A），发现XopG蛋白在不同细菌中具有较高的序列保守性，其中与柑橘黄单胞菌柑橘致病变种同源性最高。应用MEGA11.0软件的NJ法对这11个蛋白进行系统进化树的构建（图2−B），发现XopG共有6个分支，Xoo中XopG与柑橘黄单胞菌柑橘致病变种同源性最高，与野油菜致病变种、菜豆黄单胞菌和番茄黄单胞菌同源性也较高。

Figure 2.  Multi-sequence alignment and phylogenetic tree analysis of XopG protein in different pathogenic bacteria

T3SEs的表达依赖于两个重要的调控因子：HrpX和HrpG。HrpG调控hrpX表达，而HrpX可以直接结合到T3SEs和T3SS基因启动子的PIP-box基序上，促进效应因子基因及T3SS结构基因的转录。PIP-box的保守结合序列是TTCGB-N15-TTCGB-N32-YANNRT（B和Y代表C、G、T；R代表A、G、T）。但不是所有的T3SEs编码基因都具有典型的PIP-box保守结构域，部分PIP-box的TTCGB中个别碱基可以发生变化，称之为非典型的PIP-box^[36]。通过序列比对，发现xopG启动子区域的PIP保守结合序列与典型的PIP-box的保守结合序列不完全一致。如图3所示，xopG启动子区域TTCGB与TTCGB之间含有18个碱基，TTCGB与YANNRT之间含有33个碱基，与PIP-box结构相比，其第25位的T突变为G，因此xopG启动子区域含有非典型的PIP-box结构，表明xopG表达受HrpX调控。

Figure 3.  Analysis of the PIP-box in the upstream promoter region of xopG

为了验证xopG表达是否确实受HrpX调控，构建了pK18-hrpX载体用于hrpX的敲除，将其通过电击转化法转入T7174中，使用载体引物进行菌落PCR验证。结果如图4所示，野生型条带大小应为2 000 bp左右，而ΔhrpX的扩增条带为1 000 bp左右，表明hrpX基因发生了缺失突变（ΔhrpX）。其中1-3个克隆为未突变菌株，而第4个克隆为突变菌株。

Figure 4.  PCR identification of mutant hrpX

为了评估xopG的表达，将pK18gusA-xopG表达载体分别转化野生型菌株T7174、突变体菌株ΔhrpX后进行GUS染色及活力测定。结果发现在T7174的转化株中，加入GUS底物2 min后出现蓝色且随着染色时间的延长蓝色变深，而在ΔhrpX转化株中，加入GUS底物60 min还没有呈现蓝色（图5−A）。本研究团队也对gusA表达水平进行了定量检测。以ΔhrpX作为实验组，以T7174作为正对照，应用荧光法对其进行启动子活性测定。结果发现hrpX基因敲除后，GUS活性极显著低于T7174菌株，降低约53倍（图5−B）。

Figure 5.  The expression of xopG is positively regulated by HrpX

为了检测XopG是否调控Xoo的致病力，我们构建了xopG突变体菌株，野生型条带大小约为1 500 bp，突变体条带大小约为1 000 bp，二者片段大小之差正好符合预期敲除基因大小，表明突变体构建成功（图6−A）；将回补载体pHM1-xopG应用电击转化法转入ΔxopG，使用pHM1载体引物进行PCR检测，以pHM1空载为模板作为实验负对照，结果如图6−B所示，1−3号泳道均能扩增出条带，1−2号泳道条带大小为500 bp至750 bp之间符合预期，3号泳道为负对照组，结果显示回补菌株C-ΔxopG构建成功。

Figure 6.  Construction of xopG deletion mutant and C-ΔxopG strain

将构建的突变体菌株、回补菌株及野生型菌株应用剪叶法对水稻叶片进行接种实验，接种14 d调查病斑长度并拍照记录（图7−A）。T7174野生型菌株病斑长度为12 cm左右、突变体菌株ΔxopG病斑长度为6 cm左右、回补菌株C-ΔxopG病斑长度为10 cm左右，突变体ΔxopG的病斑长度显著低于野生型T7174及回补菌株C-ΔxopG，野生型T7174及回补菌株C-ΔxopG病斑长度没有显著差异（图7−B）。以上结果表明XopG正调控Xoo致病力。

Figure 7.  XopG positively regulates the pathogenicity of Xoo on rice

将pCambia-1300-xopG-eGFP重组载体和pCambia-1300-eGFP空质粒分别转入农杆菌，所得农杆菌注射烟草下表皮，避光保湿培养24 h后，继续保湿培养16 h，制成玻片在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光。结果显示：注射携带pCambia-1300-xopG-eGFP重组载体的烟草叶片细胞在细胞核、细胞质、细胞膜中均具有绿色荧光。由此，可以得出XopG蛋白可能定位于烟草细胞细胞核、细胞质和细胞膜（图8−A）。为明确XopG的亚细胞定位情况，将pRTVc-xopG-GFP及pRTV-cGFP空载体分别转化水稻原生质体，12 h后在共聚焦显微镜下观察水稻原生质体的荧光发光情况。如图8−B所示，转化pRTV-cGFP和pRTVc-xopG-GFP的水稻细胞在细胞核、细胞质、细胞膜中均具有绿色荧光，表明XopG在水稻细胞中也定位于细胞核、细胞质、细胞膜，与在烟草细胞中的定位相同。

Figure 8.  Subcellular localization of XopG in tobacco leaf cells and rice protoplasts

在革兰氏阴性菌中，T3SS对病原菌与宿主的相互作用起着重要的调控作用。T3SEs的表达依赖于两个重要的调控因子：HrpX和HrpG。HrpG调控hrpX表达，而HrpX可以直接结合到T3SEs和T3SS基因启动子的PIP-box基序上，促进效应因子基因的转录。其中HrpX通过结合到植物诱导启动子盒PIP-box上促进相关基因转录^{[9 − 12]}。本研究预测xopG基因启动子区含有一个非典型的PIP-box结构，通过启动子活力测定实验发现xopG表达受HrpX调控，因而推测XopG为Ⅲ型效应蛋白，后续我们将继续进行XopG蛋白外排实验，进一步验证XopG确为Ⅲ型效应蛋白。

通过XopG在不同病原菌中直系同源基因多序列比对及系统进化树分析，推测XopG在稻属黄单胞菌水稻致病变种和柑橘黄单胞菌柑橘致病变种中可能执行相似的功能。Deb等人将Xoo BXO43菌株对易感型水稻TN-1进行接种实验发现，xopG突变体的病斑长度显著短于野生型菌株的病斑长度^{[16 − 17]}。我们在稻属黄单胞菌水稻致病变种T7174小种中敲除xopG基因，接种水稻14 d后发现野生型菌株病斑长度约为12 cm、突变体菌株ΔxopG病斑长度约为6 cm而C-ΔxopG回补菌株病斑长度约为10 cm，突变体菌株病斑长度显著短于野生型菌株，与Deb等人实验结果一致，说明XopG正调控Xoo致病力。Deb等人发现XopU、XopV、XopP、XopG和AvrBs2蛋白可以抑制XopQ-XopX介导的水稻免疫应答^{[18 − 19]}。XopQ-XopX相互作用显示发生在细胞核中。XopG与XopQ或XopX的相互作用发生在细胞质中，表明XopG将XopQ和XopX蛋白隔离在细胞质中，从而阻止了它们在细胞核中的共定位和相互作用。同时，Deb等在黄单胞菌中发现五种效应子（XopK、XopG、XopQ、XopL和XopX）抑制flg22诱导基因WRKY33的表达^[20]。但至今为止XopG在水稻细胞中的互相作用靶标及其调控机制仍不清楚。

XopG没有可预测的跨膜结构和信号肽，在水稻原生质体的细胞核、细胞膜以及细胞质中均有XopG-GFP荧光信号，在烟草细胞中也定位于细胞核、细胞质、细胞膜。亚细胞定位结果显示XopG没有一个明显的定位情况，在细胞的核、膜及质中均存在，推测其定位可能受到其水稻中靶标蛋白的影响。

综上，本研究验证了xopG的表达受HrpX调控，明确了XopG正调控Xoo的致病力及在植物细胞中的亚细胞定位情况，为后续筛选XopG在水稻内的互作靶标蛋白，进一步揭示在Xoo侵染过程中XopG通过何种途径影响水稻的抗病性从而调控植物免疫的方式提供了实验支撑，为水稻抵抗白叶枯病提供新策略。

本研究通过对XopG蛋白结构的生物信息学分析、基因启动子活力测定，证明xopG受HrpX的正调控；通过病原菌致病力检测实验，发现xopG缺失导致Xoo侵染所致的水稻病斑长度显著低于野生型菌株T7174，C-ΔxopG菌株接种水稻的病斑长度与野生型菌株接种水稻的病斑长度无显著性，这表明XopG正调控Xoo致病力；水稻原生质体及烟草亚细胞定位实验结果表明XopG在植物细胞内定位于细胞核、细胞膜和细胞质。