Molecular cloning, expression pattern of catalase gene in Liriomyza trifolii and its response to temperature stress

本实验所用三叶草斑潜蝇于2023年2月在海南省三亚市崖城镇（E109°14′，N18°37′）豇豆地中采集获得。通过采集带有三叶草斑潜蝇幼虫的豇豆叶片后，待化蛹后收集至果蝇管，成虫羽化后用1%的蜂蜜水进行饲喂，接入放置干净豇豆苗的昆虫200目纱帐饲养笼（长50 cm×宽50 cm×高50 cm）中进行室内继代饲养。室内饲养条件为温度（26 ± 1） ℃、相对湿度（65 ± 5）%、光照16L∶8D。

总RNA提取所用Trizol Reagent试剂购自美国赛默飞世尔科技公司；纯化PCR产物试剂盒（E.Z.N.A^® Cycle-Pure Kit）购自美国Omega Bio-Tek公司；感受态细胞DH5α、普通cDNA合成试剂盒（PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）和荧光cDNA反转录试剂盒（PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser）均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；DL2000 Plus DNA Marker、2×Rapid Taq Master Mix、5×min TA/Blunt-Zero Cloning Kit、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；由北京擎科生物科技有限公司合成引物。

利用Trizol试剂提取三叶草斑潜蝇50头成虫总RNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，Micro Drop分光光度计检测RNA浓度和纯度，保存于−80 ℃备用。按照普通反转录说明书完成cDNA合成，保存于−20 ℃备用。

通过NCBI的GenBank数据库下载7种昆虫的CAT基因序列作为查询序列（query），利用TBtools软件通过BLAST在三叶草斑潜蝇转录组数据（未发表）中进行比对，并且通过NCBI搜索保守结构域（Batch CD-Search）鉴定为三叶草斑潜蝇CAT基因序列，根据序列设计三叶草斑潜蝇全长引物（表1）。以三叶草斑潜蝇反转录cDNA为模板，采用2×Rapid Taq Master Mix进行PCR扩增。反应体系（50 μL）：dd H₂O 19 μL，上下游引物（10 μmol·L⁻¹）各2 μL，cDNA 2 μL，2×Rapid Taq Master Mix 25 μL。PCR程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃延伸5 min。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，并利用Cycle-Pure Kit纯化试剂盒对目标条带的PCR产物进行纯化，纯化PCR产物连接至5 min TA/Blunt-Zero载体，转化到DH5α感受态细胞中，接着在含有氨苄卡那霉素（AMP）的LA固体培养基上进行培养，并通过挑斑、摇菌，经菌液PCR确认为阳性后，菌液送上海生工生物工程有限公司测序。

利用在线网站ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）进行相对分子质量、等电点、氨基酸残基等理化特性分析；利用在线网站ScanProsite（https://prosite.expasy.org/scanprosite/）进行基因家族位点、核心结构域、近端活性位点等分析；使用DNAman 9.0软件进行序列可视化及多序列比对；利用在线网站SignalP-6.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）进行信号肽、N-糖基化位点的预测分析；通过在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找下载序列，采用邻接法（Neighbor-joining，NJ）在MEGA 11.0软件进行聚类分析（Bootstrap1000次） 绘制系统发育树；利用SWISS-MODEL在线网站（https://swissmodel.expasy.org/）进行拉马钱德兰图绘制和蛋白质三维结构预测。

用于实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的样品采集（每个处理各20头，设3个生物学重复）。不同温度处理样品：三叶草斑潜蝇2日龄蛹在13 ℃、17 ℃、25 ℃、33 ℃、37 ℃处理1 h、在17 ℃、25 ℃、33 ℃分别处理1 h、6 h、12 h；不同发育阶段样品：三叶草斑潜蝇3龄幼虫、2日龄蛹、1日龄成虫。样品处理后用液氮速冻，保存于−80 ℃备用。总RNA提取操作同1.3，按照荧光反转录（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser）进行cDNA合成，将cDNA稀释100倍作为模板。反应体系（20.0 μL）：cDNA模板2.0 μL，DEPC水7.2 μL，上下游引物（10 μmol·L⁻¹）各0.4 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL。PCR程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火与延伸30 s，共40个循环。根据克隆获得的三叶草斑潜蝇CAT基因序列来设计荧光定量引物（表1），选择三叶草斑潜蝇β-actin^[27]作为内参基因。以25 ℃室温处理作为对照，利用2^−△△CT法^[28]计算LtCAT基因在三叶草斑潜蝇不同发育阶段和不同温度胁迫处理的相对表达量。每个样品设3个生物学重复和3个技术重复。实时荧光定量数据利用Excel 2023软件进行计算与分析，并利用GraphPad Prism 9.0软件作图，利用SPSS 26.0软件中单因素ANOVA检验的Duncan氏新复极差法（P < 0.05）进行各个处理之间的差异显著性分析。

根据三叶草斑潜蝇全长引物进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳分析，获得单一条带，目的基因片段大小符合预期结果（图1）。将克隆获得的序列在NCBI数据库中进行BLAST分析，与地中海实蝇CAT基因同源性最高，达84.57%。三叶草斑潜蝇CAT基因序列包含1个1542 bp的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），共编码513个氨基酸。对基因序列的保守结构域分析表明，LtCAT基因具有catalase家族保守结构域（22-504氨基酸位点），其中包含1个核心结构域（26-411氨基酸位点），该区域有6个CAT家族特征位点（39-62、102-120、123-140、142-160、307-334、339-365氨基酸位点）；另外还具有1个近端活性位点（62-78氨基酸位点）以及1个近端血红素配体特征（352-360氨基酸位点）（图2）。

Figure 1.  Electrophoresis map of RT-PCR product of CAT gene in Liriomyza trifolii

Figure 2.  Sequence analysis of CAT gene of Liriomyza trifolii

经ProtParam软件预测三叶草斑潜蝇CAT蛋白相对分子质量为57 762.19 Da，理论等电点为8.40，正、负电荷氨基酸残基（Arg+Lys）、（Asp+Glu）分别为59个、56个，不稳定系数为26.72，脂肪系数为69.94，体外半衰期为30 h，分子式为C₂₅₈₉H₃₉₅₉N₇₂₁O₇₅₆S₁₅。SignalP-6.0预测结果显示，三叶草斑潜蝇CAT基因无信号肽，推测其并非分泌蛋白，N-糖基化位点位于319氨基酸位点。

在SWISS-MODEL在线网站以3re8.1.A Catalase为模板，对LtCAT的蛋白结构3D模型预测，序列相似性为68.95%，模型质量评估值为0.85 ± 0.05，使用拉马钱德兰图对蛋白结构3D模型进行质量评估，结果表明该蛋白的预测3D结构模型评估质量与拉马钱德兰图的评价一致（图3）。

Figure 3.  The predicted protein structure of LtCAT gene by SWISS-MODEL

通过在NCBI查找并下载双翅目、鳞翅目、半翅目等7个目28种不同昆虫的CAT基因的氨基酸序列，与LtCAT基因编码的序列共同进行系统发育树的构建。结果表明，相同目的昆虫CAT基因均以较高置信度聚为一支，说明昆虫CAT基因在昆虫属的分类阶元上具有高度保守性（图4）。其中三叶草斑潜蝇CAT基因与橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）、瓜实蝇（Zeugodacus cucurbitae）、地中海实蝇（Ceratitis capitata）聚为一支，置信度90%，而后与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、斑翅果蝇（Drosophila suzukii）和家蝇（Musca domestica）共聚1个分支，置信度100%，表明其与其他蝇类的CAT基因进化关系更近。

Figure 4.  Phylogenetic analysis of CAT protein sequences of Liriomyza trifolii and other different insects

根据系统发育树的同源进化分析，选择同源性高的昆虫进行多序列比对（图4）。三叶草斑潜蝇与黑腹果蝇等9种双翅目昆虫的CAT蛋白序列进行多序列比对，结果表明，三叶草斑潜蝇和9种双翅目昆虫的蛋白质序列一致性达84.38%，其中三叶草斑潜蝇与地中海实蝇序列相似度最高，序列一致性达82.85%，其次是橘小实蝇序列一致性达82.07%；三叶草斑潜蝇和冈比亚按蚊相似度最低，序列一致性仅70.04%，而与模式物种黑腹果蝇进行蛋白质序列比较，相似度为76.61%（图5）。

Figure 5.  Multiple sequence alignment of CAT protein sequences of 10 Diptera insects

三叶草斑潜蝇Liriomyza trifolii；斑翅果蝇Drosophila suzukii（XP 016937998.11）；埃及伊蚊Aedes aegypti（XP 001663600.1）；瓜实蝇Zeugodacus cucurbitae（XP 011190153.1）；地中海实蝇Ceratitis capitata（XP 004519106.1）；冈比亚按蚊Anopheles gambiae（XP 314995.5）；黑腹果蝇Drosophila melanogaster（NP 536731.1）；致倦库蚊Culex quinquefasciatus（XP 038122076.1）；橘小实蝇Bactrocera dorsalis（XP 049314061.1）；家蝇Musca domestica（XP 005180638.2）。

LtCAT基因在三叶草斑潜蝇幼虫、蛹、成虫发育阶段均有表达，表达水平呈先上升后下降的趋势，其蛹期表达量最高，显著高于幼虫期和成虫期（P < 0.05）（图6）。

Figure 6.  Gene expression of LtCAT of Liriomyza trifolii at different developmental stages

三叶草斑潜蝇2日龄蛹分别在13、17、25、33、37 ℃ 5个温度梯度短时间胁迫1 h后，LtCAT基因表达水平呈现波动变化（图7）。在低温13 ℃和高温37 ℃时，LtCAT的表达量最高，且两者之间无显著差异；两者的表达水平显著高于17、25、33 ℃的表达水平（P < 0.05）。低温17 ℃和高温33 ℃相比于25 ℃对照，LtCAT基因表达量分别下降了31%和52%。表明三叶草斑潜蝇2日龄蛹在低温和高温短时间胁迫时均积极做出了响应。

Figure 7.  Gene expression of LtCAT treated at different temperatures for 1 h

相较于室温25 ℃，三叶草斑潜蝇在17 ℃和33 ℃处理不同时间的表达模式不同（图8）。在17 ℃处理时，LtCAT基因随胁迫时间的延长，其表达水平呈先上升后下降的趋势。17 ℃处理6 h时，LtCAT基因表达水平达到最高 ，显著的高于其他处理（P < 0.05）；12 h时趋近与对照（室温25 ℃）。

Figure 8.  The gene expression of LtCAT after treatment at 17 ℃，25 ℃ and 33 ℃ for different hours

而在高温33 ℃胁迫后，三叶草斑潜蝇响应迅速，且持续表现出下降的趋势。结果表明，LtCAT基因在受到低温胁迫时具有一定的响应过程，6 h后被诱导高表达；而在受到高温胁迫时响应迅速，且高温对LtCAT基因的表达具有一定的抑制作用。

随着地球气候变暖，温度胁迫成为入侵昆虫成功定殖的关键屏障，同时入侵昆虫对高温的适应性促进了它们的全球扩散^{[29, 30]}。以往对三叶草斑潜蝇在温度适应的分子机制研究主要集中在热休克转录因子（HSF）^[31]、小热休克蛋白（sHSPs）^[32]、热激蛋白（hsp20、hsp40、hsp60、hsp70、hsp90）^[33]等基因。热应激会破坏生物体内活性氧（ROS）水平的平衡，导致体内发生氧化应激反应，抗氧化酶在有效清除活性氧中起着至关重要的作用^[21]。过氧化氢酶（CAT）是关键的抗氧化酶，在抗氧化途径中起着抵抗ROS的第一道防线^{[22, 34]}。

本研究克隆得到的三叶草斑潜蝇CAT基因序列，ORF长度为1 542 bp，共编码513个氨基酸，预测相对分子质量为57.76 kDa，与二化螟CAT（56.76 kDa）、家蚕CAT（56.89 kDa）和飞蝗CAT（57.49 kDa）序列相似度较高、且分子量大小相近^[35-37]。LtCAT基因具有1个典型的CAT家族保守结构域（22-504氨基酸位点）。系统发育树结果表明：三叶草斑潜蝇和橘小实蝇、瓜实蝇、地中海实蝇亲缘关系更近，CAT基因同源性高达90%。同时在多序列比对发现三叶草斑潜蝇与黑腹果蝇、冈比亚按蚊等9种双翅目昆虫的CAT基因序列一致性达84.38%。表明CAT基因在不同物种之间较为保守。

三叶草斑潜蝇在幼虫、蛹、成虫3个不同发育阶段均有表达，且表达水平有差异，在蛹期表达量最高，其次为幼虫期，最低为成虫期（图6）。胡振等^[38]的研究表明，甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）CAT基因在低龄幼虫的表达显著低于蛹期；同时，粘虫（Mythimna separata）和二化螟（Chilo suppressalis）的CAT基因同样在不同龄期的幼虫表达量均大于成虫^{[19, 39]}，这与本研究结果一致，推测蛹期暴露在环境中，遇到的外界胁迫因素较多，容易引起CAT的高表达，而幼虫阶段处于活跃发育阶段，体内H₂O₂的积累量较成虫高，因此也需要较多的CAT用以清除体内ROS^[40]。

不同温度短时胁迫1 h的表达分析发现，LtCAT基因在13 ℃、17 ℃、25 ℃表达谱为下降后再上升的趋势，与黏虫（M. separata）的CAT基因在10 ℃、15 ℃、20 ℃、30 ℃温度胁迫1 h的表达谱类似，呈现下降后上升的趋势^[41]。而LtCAT基因在温度17 ℃、25 ℃、33 ℃处理1 h呈先上升后下降的趋势，与粘虫（M. separata）3龄幼虫在不同高温31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃处理2 h，随着温度的增加，呈现先上升后下降的趋势^[19]结果类似。LtCAT基因在25 ℃、33 ℃、37 ℃处理1 h的表达谱为下降后再上升的趋势，与寄生蜂（A. asychis）雌雄成虫的CAT基因在25 ℃、32.5 ℃、35 ℃表达趋势一致，寄生蜂在25 ℃到32.5 ℃表达量下降，35 ℃时表达量上升^[42]。但是与二化螟（C. suppressalis）的CAT基因在27 ℃、33 ℃、36 ℃表达趋势不同，该二化螟表达量是呈先上升再下降的趋势^{[35, 39]}。CAT基因受到外界不同温度胁迫后，首先在昆虫体内积极响应导致表达量升高，随着温度的升高，昆虫机体活力下降，基因表达量反而出现会下降现象。昆虫体内的热感受器（神经细胞）分布因物种和个体生命阶段的不同而有很大差异^[43]。

不同温度长时胁迫1 h、6 h、12 h的表达分析发现，LtCAT基因在17 ℃和33 ℃处理1 h、6 h、12 h的表达谱，随着温度胁迫时间从1 h延长到6 h，三叶草斑潜蝇2日龄蛹体内氧化应激水平提高，但紧随着时间延长到12 h时，表达量出现下降的趋势，这与朱彤等^[21]的研究结果类似，巴氏新小绥螨（N. barkeri）在40 ℃分别进行2、4和6 h的温度胁迫，表达量在4 h时上升诱导了体内的CAT氧化应激，6 h时下降，呈现随着时间从2 h到4 h的延长，表达量上调，到6 h表达量下调。研究结果表明，三叶草斑潜蝇CAT基因在应对高温和低温以及短时和长时处理时的响应是不同的，抗氧化酶CAT基因转录上调、下调表达可作为生物体内氧化应激反应的指示。

本研究克隆三叶草斑潜蝇Liriomyza trifolii的CAT基因，并对其进行了生物信息学等相关分析，同时，使用荧光定量PCR技术测定了CAT基因对三叶草斑潜蝇的温度胁迫和发育表达分析。本研究将为三叶草斑潜蝇的CAT基因功能研究提供重要的基础理论依据，能够给未来深入了解CAT基因的分子机制以及进一步挖掘基因功能提供一定的理论基础和数据支持。

本研究通过克隆得到三叶草斑潜蝇的CAT基因序列，命名为LtCAT，ORF长度为1 542 bp，共编码513个氨基酸；LtCAT基因在三叶草斑潜蝇的幼虫、蛹、成虫3个发育阶段体内均有表达，蛹期表达量较高；LtCAT基因在应对高低温以及短时和长时处理时的响应是不同的，抗氧化酶CAT基因转录上调、下调表达可作为生物体内氧化应激反应的指示。