Molecular docking, and molecular dynamic and antibacterial analyses of polypeptide inhibitors targeting FtsZ protein

1）质粒、菌株 金黄色葡萄球菌FtsZ蛋白的表达菌：pET28a-FtsZ（BL21）由笔者所在的实验室构建、储存；金黄色葡萄球菌菌株Staphylococcus aureus 04-02981、Bacillus subtilis 168由笔者所在的实验室储存。2）试剂 Phosphate Assay Kit（Abnova，中国台湾）、GTP（上海生工）、多肽TE101、PE101、PE102、PE103、PE104（上海生工）。3） 仪器 酶标仪MR-96A（迈瑞）。

从蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB）下载金黄色葡萄球菌FtsZ蛋白的晶体结构（PDB#4DXD）^[20]。利用MOE分子对接软件，选用Amber99力场，修正蛋白质结构数据中包含的错误后，利用构建好的5个数据库分别进行对接。对接模式为诱导契合法，利用GBVI/WSA ΔG方法对它们之间的结合自由能做最终评价^[21]。GBVI/WSA ΔG的计算公式如下，当 ΔG数值越负，表明配体与受体之间的引力越强。

式中：ΔE_Coul、ΔE_sol、ΔE_vdW分别是静电、溶剂及范德华作用，ΔSA是溶剂暴露面积。

对接完成后，挑选打分靠前的配体，保存其与蛋白质结合的PDB结构，利用安装在Ubuntu Linux（18.06）操作系统上的GROMACS（2020.03）探究蛋白质与配体之间的相互作用随时间的动态变化，分析过程简述如下。首先生成FtsZ与配体复合物的GROMACS格式的空间结构文件及拓扑文件。选用针对蛋白质从头计算加以优化的AMBER99SB全原子力场，以及TIP3P显式水分子模型。创建具有周期性边界的正十二面体计算单元，将蛋白质复合物放置在单元盒中央，蛋白质复合物与单元盒边界的距离为1.0 nm。以水分子填充单元盒，以Na⁺和Cl⁻随机取代水分子使系统呈电中性，NaCl的终浓度为0.1 mol·L⁻¹。利用最大斜率下降法使系统能量最小化，终止阈值为1000 kJ·（mol·nm）⁻¹。能量最小化后，系统在等温−等容条件下使用速度重新标度法，通过调整标准Berendsen恒温器以获得正确的动能分布。然后利用Parrinello-Rahman压力耦合算法使系统达到等温−等压状态。系统平衡后，进行50 000 000步分子动力学综合运算（Production）。在每个步骤中，利用兰纳−琼斯势能以及库伦势能方程计算系统中所有原子之间的作用力及运动状态；其中，远距离静电相互作用采用平滑粒子−网格Ewald总和法计算。利用基数样条插值法将电荷分配给网格，然后进行三维快速傅里叶变换。静电力由傅里叶空间中的相互作用力反推得到。

RMSD（Root Mean Square Deviation）值计算公式为：

式中：r_i是原子i在t时间的位置，而M是原子质量（m）的总和。

相互作用能（Interaction energy）为兰纳−琼斯势能（3）与库伦势能（4）之和。

式中：r是位置矢量长度，q是基电荷等于1.602 176 565×10⁻¹⁹C，f是电转换因子，等于1/4πε₀或138.935 458 kJ·mol⁻¹·nm e⁻²。

用LB液体培养基稀释法测定化合物的抑菌活性，首先将适量的LB液体培养基在高压水蒸气灭菌锅灭菌后，放入超净台紫外灭菌备用，向无菌96孔板内加入LB培养基，将目标化合物溶液（0.01 mol·L⁻¹）和对照组溶液，分别加入96孔板各列的第一个孔内，其次用二倍稀释法稀释到第10孔，最后接种配置好的菌液（最后一列除外）。在37 ℃恒温培养箱培养24 h后，用酶标仪测定各孔的OD₆₀₀值，所得各孔的数据由公式（5）处理可得到各化合物的抑菌活性。为了观察化合物在细菌生长阶段的不同影响，本研究还使用酶标仪的动力学程序，振板培养化合物处理的细菌，并以1 h为时间间隔连续测量其OD₆₀₀值，绘制其生长曲线，每个实验重复3次。

用LB液体培养基稀释法测定化合物的抑菌活性，首先将适量的LB液体培养基在高压水蒸气灭菌锅灭菌后，放入超净台紫外灭菌备用，向无菌96孔板内加入LB培养基，将目标化合物溶液（0.01 mol·L⁻¹）和对照组溶液，分别加入96孔板各列的第一个孔内，其次用二倍稀释法稀释到第10孔，最后接种配置好的菌液（最后一列除外）。在37℃恒温培养箱培养24 h后，用酶标仪测定各孔的OD₆₀₀值，所得各孔的数据由公式（5）处理可得到各化合物的抑菌活性。为了观察化合物在细菌生长阶段的不同影响，本研究还使用酶标仪的动力学程序，振板培养化合物处理的细菌，并以1 h为时间间隔连续测量其OD₆₀₀值，绘制其生长曲线，每个实验重复3次。

GTP酶活性的测定使用Phosphate Assay Kit（Abnova，Taiwan China）进行测定，该试剂盒测量GTP在水解释放的无机磷浓度，该测定方法基于孔雀石绿钼酸盐与游离正磷酸盐在酸性条件下形成络合物。在620～640 nm处测得的绿色磷钼酸络合物的形成与游离有机磷的浓度直接相关，该测定的应用包括定量蛋白质磷酸酶底物的磷酸化和磷酸盐释放^[22-23]。

将纯化得到的重组金黄色葡萄球菌FtsZ（6 µmol·L⁻¹）与系列稀释的化合物在室温下与50 mmol·L⁻¹ MOPS缓冲液（pH 6.5）中于96孔板中孵育10 min，对照样品中含有1%的DMSO，然后向混合物中加入200 mmol·L⁻¹氯化钾和5 mmol·L⁻¹氯化镁，最后加入500 mmol·L⁻¹ GTP，在37℃孵育30 min。孵育结束后，向各孔中加入5 μL MG Acidic Solution试剂在室温下反应10 min，最后再向各孔中加入15 μL MG Blue Solution试剂，室温下孵育20 min后用酶标仪测得各孔在620 nm处的吸收光强度值，根据磷酸根浓度吸光度标准曲线，计算得到混合物中的磷酸根浓度，用以表征酶活性，并通过与空白组相对比，计算得到多肽对于FtsZ酶活的抑制情况，每个实验重复3次。

函数（公式1）综合考虑了平动/转动熵、静电效应、溶剂效应、范德华效应、溶剂暴露面积等要素，计算结果相对准确，常用于药物虚拟筛选和构效关系探究。根据MOE的初步虚拟筛选，所有对接多肽库的结果根据评分进行从高到低排序，同时综合考虑它们与蛋白的成键数目后，命中了系列多肽化合物，其对接细节见表1。从表1可知：PE101具有最低的打分值，为−11.933 9，其E-refine值也最低，为−58.525 7，说明根据分子对接结果来看，PE101具有最好的结合稳定性。类似的，其他PE多肽的打分值也很低，但E-refine值的大小却不尽相同。相较于PE多肽而言，TE102也具有较低的打分值，但TE101具有更低的E-refine，为进一步验证短肽配体与蛋白质的结合稳定性，笔者进行了分子动力学模拟计算。

为了更清楚地阐述蛋白质与小分子配体的相互作用方式，图1展示了上述配体与FtsZ蛋白受体的对接空间位置结构示意图，并对不同配体与蛋白产生相互作用的氨基酸及作用形式进行汇总（表2），根据表2可知，所有的短肽大都倾向于和FtsZ蛋白的ASP199、LEU200、LEU209产生相互作用，且其形成的氢键的原子距离稳定在3 Å左右，表明形成的氢键稳定且可靠。

由于分子对接为静态分析，缺少对时间维度上原子运动以及水分子直接作用的分析，所以，本研究应用分子动力学方法动态分析在水溶液系统中所有原子之间的相互作用以及运动状态，从而验证小分子配体与FtsZ的相互作用强弱和结合稳定性。

D101、D102与FtsZ分子动力学模拟过程中的RMSD值计算结果如图2-A所示，两个二肽均可以在FtsZ的PC口袋中稳定存在，二者存在周期性的RMSD值跳跃，其缘由可能是二肽体积较小，不能很好的在空间结构上契合蛋白口袋，这也是导致二态打分值较低的原因；三肽TR102也存在与二肽相同的情况，但其空间位置变化较为无序，与前者周期性重复不同，可能是因为结合亲和力较低，相反的，TR101能稳定地与FtsZ口袋结合，且RMSD值稳定在0.1以下（图2-B）；四肽TE101无法在PC口袋中稳定存在，RMSD值随时间增加而持续增加，且在5 000 ps附近也不见稳定趋势，AERQ虽能在空间上大体保持位置不移动，但由图2-C能看出其稳定性也较差，波动范围较大；从图2-D可知，PE101、PE102五肽在口袋中的结合稳定性要优于PE103、PE104，其中PE104波动最为剧烈，但RMSD值始终稳定在0.1～0.2之间。

在蛋白质−配体相互作用的动力学分析中^[24-25]，相互作用能可用于表征2组相互作用分子之间的能量变化，由库仑势能和LJ势能组成，库仑势能表征分子之间的静电相互作用，LJ势能是2种物质在近距离内以相互排斥为主，而在长距离上则以相互吸引为主，表征了分子间范德华力的相互作用，相互作用能值越低，表明系统更稳定。相互作用能分析结果（图3）显示，PE101、PE102、PE103、PE104、TE101具有更低的相互作用能，说明其结合更为稳定。

根据分子对接及分子动力学分析结果，选择PE101、PE102、PE103、PE104、TE101这5个多肽进行抑菌活性测定。本实验采用肉汤微量稀释法进行多肽对金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的抑菌活性测试，实验根据CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）标准，所得结果显示（图4），多肽在500 μmol·L⁻¹的浓度下对金黄色葡萄球菌的抑制活性差距较大，PE103在其中效果最好，抑制率为25%左右，剩余多肽抑制率均在10%左右；各多肽对于枯草芽孢杆菌的作用略强于金黄色葡萄球菌，作用最强的TE101抑制率为25%，其他的五肽抑制率也达到了20%左右。另外本研究中测定了各浓度化合物处理后的细菌生长曲线，观察药物在各阶段对金黄色葡萄球菌生长的影响（图5），不难看出PE103（图5-D）能使细菌的对数生长期生长速率变缓，这可能是由于细菌细胞分裂受阻所导致。

本研究通过测定多肽对于FtsZ的酶活性影响，对多肽的作用机制进行了初步探究，结果如图6所示，根据实验结果可知，多肽化合物对FtsZ的GTPase活性并没有影响。

在本研究中，针对金黄色葡萄球菌FtsZ蛋白的晶体结构（PDB Code:4DXD），优化处理后，以其PC口袋为结合位点，构建二肽、三肽、四肽、五肽库作为配体库，对数十万个多肽进行了虚拟筛选，根据对接打分表排序选择了分值靠前的10个多肽（二肽D101、D102，三肽TR101、TR102，四肽为TE101、TE102，五肽为PE101、PE102、PE103、PE104），在此基础上，进一步利用GROMAC程序进行分子动力学研究验证其对接结合可靠性和稳定性，通过计算比较它们在分子动力学过程中的配体RMSD值变化、配体−蛋白相互作用能的高低，进一步筛选出结合能力更好的多肽。RMSD结果表明，二肽、三肽不能很好的在PC口袋中稳定存在，相较而言，在模拟过程中四肽TE101及4个五肽PE101、PE102、PE103、PE104，RMSD值稳定在0.2以下，说明其结合稳定性更佳；相互作用能的计算结果显示，以上结合稳定的5个多肽具有更低的相互作用能。综合RMSD、Interaction energy的分析结果，本研究初步命中了TE101、PE101、PE102、PE103、PE104进行研究，抑菌活性结果显示，命中多肽对金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的生长确实存在抑制。

另外，实验证明分子对接筛选的FtsZ抑制剂并不影响FtsZ的GTPase，这与之前研究报道的苯甲酰胺类衍生物的作用机制类似^[26]，已报道的多肽类抑制剂中，MciZ通过靶向枯草芽孢杆菌FtsZ蛋白抑制其组装过程发挥抑菌作用^[27-29]；ADEPs降解FtsZ蛋白来阻碍Z环的形成进而发挥抑菌作用^[30-31]；Kil通过抑制FtsZ蛋白的GTPase活性进而影响Z环的形成对大肠杆菌产生抑制作用^[32-33]，所以笔者推测，命中多肽的作用机制可能是由于其较大的分子体积占据了狭缝，导致FtsZ蛋白二级结构无法在R态和T态之间转换^[34]，完成FtsZ单体与Z环的动态交换过程，导致细菌分裂过程异常，且分子对接结果也显示，几乎所有的短肽配体都能与FtsZ狭缝中的氨基酸形成大量氢键、离子键，这可能也是稳定其蛋白结构的因素之一。

新靶点抗菌药物的开发需要庞大的先导化合物库，本研究以短肽作为配体进行分子对接筛选，并对结果进行分子动力学分析，对先导化合物库的丰富具有积极作用。