Physiological properties and antibacterial activity of a thermotolerant fungus HS1-1

2020年11月3日从湛江市湖光岩风景区距离湖面1～2 m的岸上5～15 cm深度采集的土壤中分离获得菌株，经44℃初筛和19℃复筛^[9-10]，确定为耐热真菌。在取样分离中以耐热真菌条件共分离4株耐热真菌， 选择其中的HS1-1菌株为供试菌株。

抗菌活性指示菌：交替假单胞菌属SL-1（Pseudoalteromonas sp.，登录号：FJ404757.1）、吉氏库特氏菌属SL-2（Kurthia gibsonii strain，登录号：EF032685.1）均为笔者所在的课题组从冷冻虾仁中分离鉴定保存的优势腐败菌；大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均为笔者所在实验室保存的菌。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：广东环凯微生物科技有限公司；马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）：杭州微生物试剂有限公司；改良马丁琼脂培养基：广东环凯微生物科技有限公司；改良马丁培养基：北京陆桥技术股份有限公司；营养琼脂：北京陆桥技术股份有限公司。淀粉酶培养基^[11]、糖苷酶培养基^[12]、纤维素酶培养基^[13]、壳聚糖酶培养基^[14]4种产酶筛选培养基配制方法参照文献并稍作修改，具体配方见表1。

用点植法将菌株HS1-1分别接种于PDA和改良马丁琼脂培养基中，于35℃恒温培养箱中培养2～5 d，观察菌落形态特征。

从培养基挑取少许菌丝，用乳酸石炭酸绵蓝染液染色，压片法镜检，初步鉴定菌株^[15]并完成的个体形态观察。

将活化到第三代的菌株HS1-1送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行PCR扩增、测序，完成分子鉴定。分子鉴定的具体内容：分子生物学鉴定即采用内部转录间隔区（ITS）测序的方法，选用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），采用菌落PCR的方法对筛选得到的耐热真菌HS1-1的ITS序列进行扩增。PCR扩增体系：引物ITS1和ITS4各1 µL，10 X PCR Buffer、dNTP (each 10 mmol·L⁻¹)、Taq Plus DNA Polymerase（5 U·µL⁻¹）共12.5 µL，50 mmol·L⁻¹ MgSO₄和Template (DNA)各1 µL，ddH₂O 9.5 µL，总体积为25 µL；PCR扩增条件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，共30次循环；72℃ 10 min。将PCR产物的测序结果用NCBI数据库进行BLAST对比分析，查找亲缘性近、相似性高的菌株基因序列。采用MEGA 7软件中N-J法（neighbor-joining method）自举1000次，确定菌种种属并建立系统发育树。

采用点植法将菌株接种于改良马丁琼脂培养基中，倒置于15、20、25、30、35、40、45、50℃恒温培养箱培养7 d，于 HH.S11-2电热恒温水浴锅55℃培养7 d，每个温度条件设置3个平行，采用十字交叉法测量菌落直径并观察菌落形态。

在改良马丁琼脂培养基中分别加入0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%、10%的NaCl，用点植法接种菌株于培养基上，并置于35℃下培养，每个盐浓度设置3个平行，测量菌落直径并观察菌落形态。

调节改良马丁琼脂培养基的pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。用点植法接种菌株于培养基上，并置于35℃下培养，每个梯度设置3个平行重复，测量菌落直径及观察菌落形态。

将菌株HS1-1分别接种到4种产酶筛选培养基中，倒置于恒温培养箱中35℃培养3～7 d，每种产酶培养基做3个平行。壳聚糖酶培养基能力的确定是通过观察菌落周围是否产生透明圈^[14]，淀粉酶结果通过碘液染色观察水解圈的大小来确定；检测糖苷酶以菌落周围有无蓝色产生为依据，有则说明有产糖苷酶的能力，反之，则无。纤维素酶培养基需要用95%乙醇配制的0.1%刚果红染色液染色，再用1 mol·L⁻¹氯化钠脱色，染色和脱色时间均为1 h^[16]，观察是否出现脱色圈。

将活化好的菌株HS1-1挑取一环分别接种到装有100 mL PDB和改良马丁培养基的250 mL三角瓶中，35℃，135 r·min⁻¹摇床（HZQ-F160振荡培养箱）培养7 d，经真空抽滤和微孔滤膜过滤后，取部分发酵液，用N-1100D-WB旋转蒸发仪浓缩5倍，发酵原液和浓缩液均用于抗菌活性测定。

抗菌活性测定： 挑取活化好的指示菌，接种到生理盐水中，振荡均匀并稀释不同倍数，制备成OD₆₀₀值为0.6的菌悬液^[17]。在提前制备好的素琼脂平板中放好无菌牛津杯，倒入含有1∶100比例菌悬液的营养琼脂，待凝固后拔出牛津杯并注入100 µL发酵液或发酵浓缩液，于4℃冰箱中扩散3～4 h^[18]，置于37℃培养24 h并测量抑菌圈直径，抑菌圈直径算上牛津杯直径（牛津杯直径为7.8 mm），无抑菌圈以牛津杯直径计。

对菌落直径、抑菌圈直径等数据均利用JMP Pro软件进行显著性差异分析。取显著性水平α为0.05，通过单因素方差分析，用所有对Tukey HSD来比较均值，P<0.05表示有显著性差异，用不同英文字母表示具有显著性差异，最后采用Origin软件进行绘图。

耐热真菌HS1-1在PDA和改良马丁琼脂培养基上均能生长，且在改良马丁琼脂培养基上生长较为良好，因而用改良马丁琼脂培养基作为菌株培养的最适固体培养基。从图1可见，35℃培养2～3 d的菌落形态观察中发现菌落圆形平坦，菌丝自中央向外周延展，由致密到疏松，菌丝发达呈米黄色，有放射性皱褶和晕圈。随着不同培养天数、pH、温度和盐浓度变化，菌落呈现轻微颜色差别，或烟绿色或米黄色。

经显微镜观察（图2）发现，菌株HS1-1培养2 d后菌丝透明且显青色，有分生孢子梗和分生孢子头，顶囊成烧瓶状，直径约20 µm，小梗单层排列，成木栅状，孢子为球型，直径约2.5 µm。初步鉴定菌株HS1-1为曲霉属。王世苗等^[19]观察烟曲霉呈绒状，颜色为暗烟绿色；电子显微镜结果观察到球形、绿色的分生孢子，分生孢子梗光滑，顶囊呈烧瓶状，与本研究菌株相似。

经基因组DNA提取，PCR扩增和凝胶电泳观察，菌株HS1-1在500～600 bp有清晰条带。提交ITS序列至GenBank获得登录号，利用BLAST进行同源性对比分析，构建系统发育树（图3）。HS1-1（登录号为MZ413293）与Aspergillus fumigatus IR-SGS-Y5聚在同一分支上，遗传进化距离相近。结合形态学观察和分子鉴定，确定该耐热真菌为烟曲霉。

不同温度条件下菌株生长情况见图4。菌株HS1-1在15～50℃的温度范围内均能生长，15℃生长最缓慢，55℃则无法生长。从1～3 d可看出，40℃时生长速度明显高于其他温度，其次是35℃，因此该菌最适生长温度为40℃，该菌在生长温度范围内的生长能力强弱顺序为40℃、35℃、45℃、30℃、25℃、50℃、20℃、15℃。最适温度是40℃，50℃仍能生长，具有明显耐热性，为耐热真菌。烟曲霉最适生长温度一般为37℃^[20]，有研究发现烟曲霉在37℃培养时菌落直径最大，且在50℃、55℃仍能生长^[21]，这与本研究生长情况相似。观察不同温度菌落形态，在设置的温度范围内，较高或者较低温度条件下菌丝附着能力减弱，孢子易脱落，菌落沟纹加深，颜色较浅。

菌株HS1-1在不同盐浓度的生长情况见表2。在35℃时菌株在0～10%的盐浓度范围内均能生长，2～3 d时1%～2%盐浓度明显优于其他组，4 d时盐浓度0～4%的菌落直径均大于84.3 mm，接近平板直径。故该菌适宜盐浓度范围为0～4%，最佳生长盐浓度是1%～2%，具备一定耐盐性。观察菌株第7天的生长形态发现，不同盐浓度的菌落形态差异不大，菌落中央向外周扩散呈现黄色由深变浅。

不同pH条件下菌株生长情况见表3。该菌在pH为3～12的范围内均能生长，pH在6～9时长势良好，pH2时菌株不生长。1～4 d时pH为6和7时菌落直径显著大于其他pH（P<0.05），表明该菌最适宜pH范围为6～7，且适应酸碱范围广，具有极强耐酸碱能力。对比酸性条件（pH2～pH3），菌株在较碱性条件（pH11～pH12）生长更具优势，说明耐强碱能力强。不同pH菌落形态各异（图5），pH3倒置培养时观察到菌落中央向下生长，呈突起状。pH为3～5时，菌落颜色较深，褶皱明显，菌落边缘不规整；pH≥6时，菌落颜色较浅，褶皱较少或无褶皱，菌落多呈圆形。

耐热真菌HS1-1在不同产酶筛选培养基的菌落生长情况见图6。微生物不能直接利用淀粉、蛋白质和脂肪等大分子，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后才能利用。菌株在4种产酶培养基上均能生长，说明该菌能产生相应的酶并以可溶性淀粉、乳糖、羧甲基纤维素和壳聚糖作为唯一碳源供自身生长，且利用可溶性淀粉、乳糖和羧甲基纤维素的能力较强，利用壳聚糖的能力较弱。

菌株HS1-1在PDB和改良马丁培养基上所得的发酵液及发酵浓缩液（5倍浓缩）的抗菌情况见表4。该菌的PDB发酵产物对5种革兰氏阴性和革兰氏阳性菌均无明显抑制效果；PDB发酵液经5倍浓缩后均产生抑菌圈，推断可能由于抑菌活性物质富集而出现明显抑菌效果；在改良马丁培养基所得的发酵液对SL-1、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、SL-2均有抗菌活性，而对金黄色葡萄球菌无明显抗菌活性；改良马丁培养基发酵液经5倍浓缩后，以SL-1为指示菌时抑菌效果减弱，可能是在旋转蒸发过程中高温（50℃）破坏了部分抑制SL-1指示菌的活性成分，但其他指示菌的结果显示抑菌效果都增强了。

本研究以1株湖光岩玛珥湖来源的耐热真菌HS1-1为研究对象，观察其菌落特征，以菌丝形态、孢子、顶囊等特征初步判断该菌为烟曲霉，结合分子水平鉴定确定该菌为烟曲霉。不同温度、盐浓度、pH条件下菌株的生长研究结果表明，耐热烟曲霉HS1-1温度生长范围较广，15～50℃均能生长，有学者研究发现烟曲霉在30～42℃都能较好生长^[22]，这与本研究结果相符合，后续实验可以继续补充探究15℃以下温度条件以探究该菌的最低生长温度。张晋卿等^[23]发现烟曲霉AF293在酵母浸膏培养基中的最适宜生长温度是37℃, 而在改良马丁琼脂培养基中耐热烟曲霉HS1-1的最适生长温度在40℃，说明湖光岩玛珥湖来源的烟曲霉在特定适宜培养基上有更高的最适生长温度，且在高温条件下更具生长优势。菌株HS1-1的最适盐浓度范围在1%～2%，根据其对盐浓度的适应性，说明该菌属于弱嗜盐微生物。吴嘉鑫等^[17]对1株海洋耐热真菌C051进行研究，发现菌株C051在pH为3～9范围内均可以生长，而耐热真菌HS1-1在pH为3～12的范围内均能生长，相比之下湖光岩来源菌株HS1-1能适应较广的酸碱环境，有较强抗逆性，并且对碱性环境的抗性更强，这可能是由于湖光岩特殊的环境所造就的，生物的特性更具有多样化。有研究人员从不同碱性生境分离出多株真菌，并从其次生代谢产物中发现多种新颖结构化合物^[24]，HS1-1在pH为12时仍能生长，说明耐热真菌HS1-1可以适应碱性生境，研究其次级代谢产物将有希望发现新颖结构的化合物。

产酶研究发现该菌株周围无产生水解圈和特定颜色变化，这可能与该菌株酶的分泌能力和生理特性有关。郭潇等^[25]在研究湖光岩细菌的纤维素酶降解活性也出现了这一现象。猜测该方法测定下菌株产生水解酶的量不多，在菌株生长的同时培养基的透明圈现象已被菌体生长所覆盖。后续如做进一步研究，可以考虑浓缩粗酶液于特定产酶培养基中，具体参照Chirom等^[26]的方法稍加修改来更加明确该菌的产酶特性。

抗菌活性是微生物研究的热点，近年来研究人员致力于为抗菌物质开发提供新手段和新渠道，倪孟祥等^[27]从北极海泥中分离得到的其中1株菌株H5被鉴定为烟曲霉属且其发酵液对细菌、真菌和耐药菌有不同抑制活性。本研究也探究了对几种常见革兰氏阳性和阴性菌的拮抗性，耐热真菌具有生长快的特点，下一步拟对菌株HS1-1的其他抗菌活性及生物活性进行研究，为该菌的开发利用提供基础。