Chemical Constituents from the Twigs and Leaves of Croton Laevigatus, a Li Folk Medicine

核磁共振波谱仪(德国Bruker AV-500)；旋转蒸发仪(德国Heidolph Laborota)；Sephadex LH-20(德国Merck)；氘代试剂(德国Merck)；分析型高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies 1260 Infinity)；半制备高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies 1260 Infinity Ⅱ)；半制备色谱柱(C₁₈，250 mm × 10.0 mm，ID)(日本COSMOSIL公司)；超纯水装置(上海博讯实业有限公司)；薄层色谱硅胶板及柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂)；色谱级试剂(天津康科德公司)；其他试剂均为重蒸工业试剂；顺铂(上海源叶生物科技有限公司)；阿维菌素(上海源叶生物科技有限公司)；人慢性髓原白血病细胞株K562、人肝癌细胞株BEL-7401、人胃癌细胞株SCG-7901、人肺癌细胞株A549和HeLa人宫颈癌细胞均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；全齿复活线虫由云南大学莫明和教授提供。

光叶巴豆采自海南省昌江县，经中国热带农业科学院热带生物技术研究所黄圣卓博士鉴定为大戟科(Euphorbiaceae)巴豆属(Croton)植物光叶巴豆(Croton laevigatus)。

将干燥的光叶巴豆枝叶样品(4.15 kg)经φ=95%的乙醇常温浸泡提取3次，时间依次为7、5、3 d，合并提取液，过滤，减压浓缩至无醇味，得乙醇提取物。将乙醇提取物分散于水中形成悬浊液，再依次用乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，对萃取液进行减压浓缩得到干浸膏，最终获得乙酸乙酯部位(159.0 g)、正丁醇部位(70.0 g)。

乙酸乙酯萃取物(159.0 g)经小孔吸附树脂，以甲醇/水(40%～100%，体积分数)进行梯度洗脱，经薄层色谱检测，合并相同流分后，得到14个组分(Fr.1～Fr.14)。Fr.2 (790.0 mg)经Sephadex LH-20凝胶柱色谱洗脱，洗脱剂为甲醇，得到6个亚组份(Fr.2.1～Fr.2.6)，Fr.2.1 (433.7 mg)经硅胶柱色谱，以石油醚−乙酸乙酯(3∶1～2∶1，体积比)为洗脱剂，得到化合物1 (5.0 mg)、化合物2 (4.6 mg)。Fr.3 (500.0 mg)经Sephadex LH-20凝胶柱色谱洗脱，洗脱剂为甲醇，得到2个亚组份Fr.3.1和Fr.3.2，Fr.3.1 (333.1 mg)经硅胶柱色谱，以氯仿−甲醇(250∶1～50∶1，体积比)为洗脱剂，得到化合物3 (7.0 mg)。Fr.4 (4.29 g)经ODS柱色谱，以甲醇/水(40%～100%，体积分数)进行梯度洗脱，得到16个亚组份(Fr.4.1～Fr.4.16)，Fr.4.3经Sephadex LH-20凝胶柱色谱洗脱，洗脱剂为甲醇，得到4个流分(Fr.4.3.1～Fr.4.3.4)，Fr.4.3.3(98.1 mg)经硅胶柱色谱，以氯仿−甲醇(500∶1～400∶1，体积比)为洗脱剂，得到化合物8 (13.1 mg)，Fr.4.3.4 (50.8 mg)经硅胶柱色谱，以石油醚−乙酸乙酯(6∶1～5∶1，体积比)为洗脱剂，得到化合物9(4.1 mg)、12 (1.1 mg)。Fr.4.8(53.9 mg)经硅胶柱色谱，以石油醚−乙酸乙酯(16∶1～8∶1，体积比)为洗脱剂，得到化合物4(1.7 mg)、5 (3.1 mg)。Fr.4.9 (283.6 mg)经硅胶柱色谱，以石油醚−乙酸乙酯(19∶1～16∶1，体积比)为洗脱剂，得到化合物6 (17.3 mg)。Fr.4.12(131.6 mg)经硅胶柱色谱，以石油醚−乙酸乙酯(16∶1～12∶1，体积比)为洗脱剂，得到化合物7 (4.2 mg)。Fr.5 (10.0 g)经ODS柱色谱，以甲醇/水(50%～100%，体积分数)进行梯度洗脱，得到27个亚组份(Fr.5.1-Fr.5.27)，Fr.5.2 (73.5 mg)经Sephadex LH-20凝胶柱色谱洗脱，洗脱剂为甲醇，得到2个流分(Fr.5.2.1和Fr.5.2.2)，Fr.5.2.1 (17.1 mg)经半制备型高效液相色谱，以C₁₈柱为色谱柱，用甲醇/水(45∶55，体积比)为洗脱剂，得到化合物10 (2.1 mg)，Fr.5.3 (252.6 mg)经Sephadex LH-20凝胶柱色谱洗脱，洗脱剂为甲醇，得到5个流分(Fr.5.3.1-Fr.5.3.5)，Fr.5.3.5 (22.2 mg)经半制备型高效液相色谱，以C₁₈柱为色谱柱，用甲醇/水(47∶53，体积比)为洗脱剂，得到化合物11 (2.4 mg)。

利用贝尔曼漏斗法^[9]和MTT法^[10]分别测定化合物1～12的全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)致死活性和细胞毒活性。

本实验从光叶巴豆中一共分离得到12个化合物，并根据¹H NMR、¹³C NMR和ESI-MS数据鉴定了化合物1～12的结构（图1）

Figure 1.  The chemical structures of compounds 1 - 12

化合物1 无色油状物(CHCl₃)；ESI-MS：m/z 229 [M+H]⁺，分子式C₁₃H₂₄O₃；¹H NMR (CDCl₃，500 MHz) δ：5.75 (1H，dd，J = 15.7，6.0 Hz，H-8)，5.58 (1H，d，J = 15.7 Hz，H-7)，4.39 (1H，t，J = 6.0 Hz，H-9)，3.86 (1H，m，H-3)，1.93 (1H，m，H-5)，1.78 (1H，d，J = 12.0 Hz，H-4a)，1.61 (1H，d，J = 12.0 Hz，H-2a)，1.52 (1H，m，H-2b)，1.35 (1H，d，J = 12.0 Hz，H-4b)，1.30 (3H，d，J = 6.0 Hz，H-10)，0.96 (3H，s，H-11)，0.87 (3H，s，H-12)，0.79 (3H，d，J = 6.8 Hz，H-13)；¹³C NMR (CDCl₃，125 MHz) δ：39.6 (C-1)，45.3 (C-2)，66.8 (C-3)，39.3 (C-4)，34.2 (C-5)，77.0 (C-6)，133.1 (C-7)，134.5 (C-8)，68.7 (C-9)，24.0 (C-10)，25.1 (C-11)，24.7 (C-12)，16.0 (C-13)。以上波谱数据与文献[11]报道的基本一致，故鉴定为(3S，5R，6S，7E，9R)-3，6-dihydroxy-5，6-dihydro-β-ionol。

化合物2 无色油状物(CHCl₃)；ESI-MS：m/z 225 [M+H]⁺，分子式C₁₃H₂₀O₃；¹H NMR (CDCl₃，500 MHz) δ：5.90 (1H，m，H-7)，5.85 (1H，m，H-8)，5.78 (1H，s，H-4)，4.40 (1H，m，H-9)，2.44 (1H，d，J = 17.1 Hz，H-2a)，2.23 (1H，d，J = 17.1 Hz，H-2b)，1.89 (3H，s，H-13)，1.29 (3H，d，J = 6.4 Hz，H-10)，1.07 (3H，s，H-11)，1.00 (3H，s，H-12)；¹³C NMR (CDCl₃，125 MHz) δ：41.3 (C-1)，49.8 (C-2)，198.2 (C-3)，127.0 (C-4)，163.0 (C-5)，79.2 (C-6)，129.0 (C-7)，135.9 (C-8)，68.2 (C-9)，24.2 (C-10)，23.0 (C-11)，23.9 (C-12)，19.1 (C-13)。以上波谱数据与文献[12]报道的基本一致，故鉴定为吐叶醇。

化合物3 无色油状物(CHCl₃)；ESI-MS：m/z 227 [M+H]⁺，分子式C₁₃H₂₂O₃；¹H NMR (CDCl₃，500 MHz) δ：5.83 (1H，dd，J = 15.8，5.8 Hz，H-8)，5.70 (1H，dd，J = 15.8，1.0 Hz，H-7)，4.42 (1H，m，H-9)，2.83 (1H，d，J = 13.6 Hz，H-2a)，2.41 (1H，t，J = 13.0 Hz，H-4a)，2.26 (1H，m，H-4b)，2.19 (1H，ddd，J = 13.7，4.5，2.2 Hz，H-5)，1.90 (1H，dd，J = 13.6，1.9 Hz，H-2b)，1.32 (3H，d，J = 6.4 Hz，C-10)，0.96 (3H，s，C-12)，0.93 (3H，s，C-11)，0.88 (3H，d，J = 6.4 Hz，C-13)；¹³C NMR (CDCl₃，125 MHz) δ：42.7 (C-1)，51.6 (C-2)，211.6 (C-3)，36.6 (C-4)，45.3 (C-5)，77.3 (C-6)，131.9 (C-7)，135.3 (C-8)，68.5 (C-9)，24.1 (C-10)，24.6 (C-11)，24.5 (C-12)，16.0 (C-13)。以上波谱数据与文献[13]报道的基本一致，故鉴定为4，5-dihydroblumenol A。

化合物4 无色油状物(CHCl₃)；ESI-MS：m/z 239 [M+H]⁺，分子式C₁₅H₂₆O₂；¹H NMR (CDCl₃，500 MHz) δ：4.98 (1H，s，H-15b)，4.84 (1H，s，H-15a)，3.95 (1H，dd，J = 11.7，4.9 Hz，H-1)，3.51 (1H，t，J = 10.1 Hz，H-6)，2.29 (2H，m，H-3)，2.21 (1H，m，H-11)，2.06 (1H，dt，J = 14.0，3.2 Hz，H-9b)，1.89 (1H，m，H-2a)，1.84 (1H，d，J = 10.1 Hz，H-5)，1.62 (1H，dd，J = 11.7，5.9 Hz，H-2b)，1.47 (1H，m，H-8b)，1.29 (1H，m，H-8a)，1.26 (1H，m，H-7)，1.05 (1H，td，J = 14.0，4.0 Hz，H-9a)，0.94 (3H，d，J = 7.1 Hz，H-13)，0.87 (3H，s，H-14)，0.84 (3H，d，J = 7.1 Hz，H-12)；¹³C NMR (CDCl₃，125 MHz) δ：68.3 (C-1)，31.2 (C-2)，29.9 (C-3)，145.6 (C-4)，61.8 (C-5)，67.3 (C-6)，49.2 (C-7)，18.2 (C-8)，34.5 (C-9)，40.2 (C-10)，26.6 (C-11)，16.4 (C-12)，21.1 (C-13)，21.5 (C-14)，114.4 (C-15)。以上波谱数据与文献[14]报道的基本一致，故鉴定为5-epi-eudesma-4 (15)-ene-1β，6β-diol。

化合物5 淡黄色油状物(CHCl₃)；ESI-MS：m/z 239 [M+H]⁺，分子式C₁₅H₂₆O₂；¹H NMR (CDCl₃，500 MHz) δ：1.50～1.90 (8H，m，H-1，2，3，8，9)，1.25 (3H，s，H-14)，1.21 (1H，m，H-5)，1.17 (3H，s，H-15)，1.04 (6H，s，H-12，13)，0.91 (1H，m，H-8)，0.64 (1H，ddd，J = 11.0，9.6，6.2 Hz，H-7)，0.43 (1H，dd，J = 11.0，9.6 Hz，H-6)；¹³C NMR (CDCl₃，125 MHz) δ：56.5 (C-1)，23.9 (C-2)，41.3 (C-3)，80.5 (C-4)，48.6 (C-5)，28.4 (C-6)，26.8 (C-7)，20.3 (C-8)，44.6 (C-9)，75.2 (C-10)，19.7 (C-11)，28.8 (C-12)，16.6 (C-13)，24.7 (C-14)，20.5 (C-15)。以上波谱数据与文献[15]报道的基本一致，故鉴定为aromadendrane-4β，10β-diol。

化合物6 无色油状物(CHCl₃)；ESI-MS：m/z 239 [M+H]⁺，分子式C₁₅H₂₆O₂；¹H NMR (CDCl₃，500 MHz) δ：5.01 (1H，s，H-15a)，4.73 (1H，s，H-15b)，3.70 (1H，t，J = 9.8 Hz，H-6)，3.41 (1H，dd，J = 11.6，4.7 Hz，H-1)，2.32 (1H，ddd，J = 13.2，5.0，2.1 Hz，H-3a)，2.23 (1H，m，H-11)，2.07 (1H，td，J = 13.2，5.3 Hz，H-3b)，1.90 (1H，m，H-9a)，1.86 (1H，m，H-2b)，1.73 (1H，d，J = 9.8 Hz，H-5)，1.55 (1H，m，H-2a)，1.51 (1H，m，H-8b)，1.29 (1H，m，H-7)，1.24 (1H，m，H-8a)，1.23 (1H，m，H-9b)，0.93 (3H，d，J = 7.0 Hz，H-12)，0.85 (3H，d，J = 7.0 Hz，H-13)，0.69 (3H，s，H-14)，¹³C NMR (CDCl₃，125 MHz) δ：79.1 (C-1)，32.0 (C-2)，35.2 (C-3)，146.3 (C-4)，56.0 (C-5)，67.2 (C-6)，49.4 (C-7)，18.2 (C-8)，36.4 (C-9)，41.8 (C-10)，26.1 (C-11)，21.2 (C-12)，16.3 (C-13)，11.7 (C-14)，107.9 (C-15)。以上波谱数据与文献[16]报道的基本一致，故鉴定为ent-4 (15)-eudesmene-1β，6α-diol。

化合物7 淡黄色油状物(CHCl₃)；ESI-MS：m/z 239 [M+H]⁺，分子式C₁₅H₂₆O₂；¹H NMR (CDCl₃，500 MHz) δ：4.95 (1H，d，J = 1.1 Hz，H-15b)，4.81 (1H，d，J = 1.1 Hz，H-15a)，3.59 (1H，dd，J = 11.3，4.9 Hz，H-1)，3.23 (1H，dd，J = 9.8，2.4 Hz，H-7)，2.33 (1H，m，H-6)，2.30 (1H，m，H-3b)，2.11 (1H，td，J = 13.5，5.7 Hz，H-3a)，1.92 (1H，m，H-8b)，1.87 (1H，m，H-2a)，1.83 (1H，d，J = 10.9 Hz，H-5)，1.74 (1H，m，H-9b)，1.74 (1H，m，H-11)，1.50 (1H，m，H-2b)，1.39 (1H，m，H-9a)，1.32 (1H，m，H-8a)，0.99 (3H，d，J = 6.8 Hz，H-13)，0.90 (3H，d，J = 6.9 Hz，H-12)，0.66 (3H，s，H-14)；¹³C NMR (CDCl₃，125 MHz) δ：79.1 (C-1)，32.0 (C-2)，35.1 (C-3)，149.1 (C-4)，56.6 (C-5)，39.5 (C-6)，82.9 (C-7)，26.2 (C-8)，37.5 (C-9)，49.7 (C-10)，31.5 (C-11)，14.9 (C-12)，20.7 (C-13)，12.4 (C-14)，107.8 (C-15)。以上波谱数据与文献[17]报道的基本一致，故鉴定为(7R*)-opposit-4 (15)-ene-1β，7-diol。

化合物8 乳白色油状物(CHCl₃)；ESI-MS：m/z 419 [M+H]⁺，分子式C₂₂H₂₆O₈；¹H NMR (CDCl₃，500 MHz) δ：6.58 (4H，s，H-2，6，2′，6′)，5.53 (2H，s，OH-4，4′)，4.73 (2H，d，J = 3.9 Hz，H-7，7′)，4.28 (2H，dd，J = 8.8，6.5 Hz，H-9a，9′a)，3.92 (2H，m，H-9b，9′b)，3.89 (12H，s，OMe-3，5，3′，5′)，3.09 (2H，m，H-8，8′)；¹³C NMR (CDCl₃，125 MHz) δ：54.5 (C-8，8′)，86.1 (C-7，7′)，71.9 (C-9，9′)，132.1 (C-1，1′)，102.8 (C-2，6，2′，6′)，147.2 (C-3，5，3′，5′)，134.3 (C-4，4′)，56.5 (OMe-3，5，3′，5′)。以上波谱数据与文献[18]报道的基本一致，故鉴定为丁香脂素。

化合物9 乳白色油状物(CHCl₃)；ESI-MS：m/z 739 [2M+Na]⁺，分子式C₂₀H₂₀O₆；¹H NMR (CDCl₃，500 MHz) δ：6.90 (2H，d，J = 2.1 Hz，H-5，5′)，6.89 (2H，d，J = 8.1 Hz，H-8，8′)，6.82 (2H，dd，J = 8.1，2.1 Hz，H-7，7′)，4.74 (2H，d，J = 4.2 Hz，H-4，4′)，4.24 (2H，dt，J = 9.2，6.9 Hz，H-2b，2b′)，3.91 (6H，s，OMe-6，6′)，3.88 (2H，dd，J = 9.2，3.6 Hz，H-2a，2a′)，3.10 (2H，m，H-3，3′)；¹³C NMR (CDCl₃，125 MHz) δ：71.8 (C-2，2′)，54.3 (C-3，3′)，86.0 (C-4，4′)，108.7 (C-5，5′)，146.8 (C-6，6′)，119.1 (C-7，7′)，114.4 (C-8，8′)，145.4 (C-9，9′)，133.1 (C-10，10′)，56.1 (OMe-6，6′)。以上波谱数据与文献[19]报道的基本一致，故鉴定为rel- (3R，3′S，4R，4′S)-3，3′，4，4′-tetrahydro-6，6′-dimethoxy[3，3′-bi-2H-benzopyran]-4，4′-diol。

化合物10 无色油状物(CHCl₃)；ESI-MS：m/z 411 [M+Na]⁺，分子式C₂₁H₂₄O₇；¹H NMR (CDCl₃，500 MHz) δ：6.92 (2H，m，H-2′，5′)，6.82 (1H，dd，J = 8.1，1.8 Hz，H-6′)，6.58 (2H，s，H-2，6)，5.59 (1H，s，OH-4′)，5.49 (1H，s，OH-4)，4.75 (1H，d，J = 4.8 Hz，H-7)，4.72 (1H，d，J = 4.8 Hz，H-7′)，4.26 (2H，m，H-9b，9′b)，3.91 (3H，s，OMe-3′)，3.90 (6H，s，OMe-3，5)，3.88 (2H，m，H-9a，9′a)，3.10 (2H，m，H-8，8′)；¹³C NMR (CDCl₃，125 MHz) δ：132.3 (C-1)，102.8 (C-2，6)，147.3 (C-3，5)，134.4 (C-4)，86.0 (C-7)，54.3 (C-8)，71.8 (C-9)，133.0 (C-1′)，108.7 (C-2′)，146.8 (C-3′)，145.4 (C-4′)，114.4 (C-5′)，119.1 (C-6′)，86.3 (C-7′)，54.6 (C-8′)，72.0 (C-9′)，56.5 (OMe-3，5)，56.1 (OMe-3′)。以上波谱数据与文献[20]报道的基本一致，故鉴定为(+)-皮树脂醇。

化合物11 无色油状物(CHCl₃)；ESI-MS：m/z 583 [M-H]⁻，分子式C₃₁H₃₆O₁₁；¹H NMR (CDCl₃，500 MHz) δ：6.96 (1H，d，J = 1.2 Hz，H-2″)，6.90 (1H，d，J = 1.5 Hz，H-2′)，6.89 (1H，d，J = 8.1 Hz，H-5′)，6.85 (1H，d，J = 8.2 Hz，H-5″)，6.83 (1H，dd，J = 8.1，1.5 Hz，H-6′)，6.74 (1H，dd，J = 8.2，1.2 Hz，H-6″)，6.63 (2H，s，H-2，6)，4.99 (1H，t，J = 3.9 Hz，H-7″)，4.77 (1H，d，J = 4.9 Hz，H-7′)，4.75 (1H，d，J = 4.9 Hz，H-7)，4.29 (2H，m，H-9a，9′a)，4.12 (1H，m，H-8″)，3.93 (3H，m，H-9b，9′b，9″a)，3.91 (3H，s，OMe-3′)，3.90 (6H，s，OMe-3，5)，3.89 (3H，s，OMe-3″)，3.49 (3H，m，H-9″b)，3.12 (2H，m，H-8，8′)；¹³C NMR (CDCl₃，125 MHz) δ：138.0 (C-1)，102.9 (C-2，6)，153.6 (C-3，5)，134.4 (C-4)，86.2 (C-7)，54.7 (C-8)，72.3 (C-9)，132.9 (C-1′)，108.7 (C-2′)，146.9 (C-3′)，145.5 (C-4′)，114.4 (C-5′)，119.1 (C-6′)，85.9 (C-7′)，54.2 (C-8′)，71.7 (C-9′)，131.4 (C-1″)，108.5 (C-2″)，146.7 (C-3″)，145.0 (C-4″)，114.3 (C-5″)，118.9 (C-6″)，72.7 (C-7″)，87.3 (C-8″)，60.7 (C-9″)，56.4 (OMe-3,5)，56.1 (OMe-3′，3″)。以上波谱数据与文献[21]报道的基本一致，故鉴定为thero-ficusesquilignan A。

化合物12 淡黄色油状物(CHCl₃)；ESI-MS：m/z 179 [M+H]⁺，分子式C₁₀H₁₀O₃；¹H NMR (CDCl₃，500 MHz) δ：7.64 (1H，d，J = 16.0 Hz，H-7)，7.43 (2H，d，J = 8.6 Hz，H-2，6)，6.84 (2H，d，J = 8.6 Hz，H-3，5)，6.30 (1H，d，J = 16.0 Hz，H-8)，3.79 (3H，s，OMe-9)；¹³C NMR (CDCl₃，125 MHz) δ：127.1 (C-1)，130.1 (C-2，6)，116.0 (C-3，5)，157.7 (C-4)，144.6 (C-7)，115.5 (C-8)，167.9 (C-9)，51.7 (OMe-9)。以上波谱数据与文献[22]报道的基本一致，故鉴定为反式对羟基肉桂酸甲酯。

本研究从光叶巴豆中共分离鉴定了12个化合物，其中，包括降倍半萜类化合物3个，倍半萜类化合物4个及苯丙素类化合物5个，全齿复活线虫致死活性测试结果(表1)表明，倍半萜类化合物1～7对全齿复活线虫的致死活性相对较低或没有，而苯丙素类化合物8～12对全齿复活线虫具有较好的致死活性。所有化合物均无细胞毒活性。

本实验获得的12个化合物均为首次从光叶巴豆中分离得到，其中，苯丙素类化合物(8～12)对全齿复活线虫具有较好的致死活性，以反式对羟基桂皮酸甲酯(12)活性最高。据文献[23]报道，顺式对羟基桂皮酸甲酯具有较好的全齿复活线虫致死活性，因此，推测苯丙素类化合物可能对全齿复活线虫具有一定程度的致死活性，其具体作用机制尚有待进一步的研究。前人对光叶巴豆研究多是基于抗炎活性、细胞毒活性、酶抑制活性等方面^[5-7]。本研究首次对光叶巴豆化合物进行了全齿复活线虫致死活性和细胞毒活性测试，旨在进一步探索光叶巴豆的开发利用，使这一传统黎药资源能在更广阔的领域得到利用。