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维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种人鱼共患的革兰阴性病原菌[1],其分布广泛、致病性较强,给水产养殖带来巨大的经济损失[2]。人感染后会出现菌血症、脑膜炎等症状,甚至有死亡的危险[3]。在革兰氏阴性菌中,III型分泌系统(Type III secretion systems, T3SS)通过分泌胞外蛋白和毒力蛋白介导毒力作用的发挥[4],是细菌向宿主细胞分泌毒力因子的重要途径,如铜绿假单胞菌、沙门氏菌及福氏志贺菌对宿主的毒害作用皆由T3SS介导[5]。在急性感染期间,铜绿假单胞菌中T3SS特别活跃,感染者的死亡率增加[6-7]。T3SS在细菌病原体中十分保守,其表达由exoenzyme S transcriptional regulator ExsA激活[8]。在副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)中,HlyU正调控exsA基因启动子,激活T3SS的表达[9];在铜绿假单胞菌中,ExsA可调控细胞外金属蛋白酶ImpA的表达,后者通过T3SS分泌到宿主体内后,可以裂解巨噬细胞表面蛋白CD44,以抑制巨噬细胞对细菌细胞的吞噬作用[10]。免疫球蛋白M(IgM)是一种普遍存在于脊椎动物中,由效应B淋巴细胞特异性分泌的免疫球蛋白[11-12]。根据Ig重链(heavy chain, H)恒定区的差异,硬骨鱼类被划分为IgM、IgD、IgZ/T、IgM和IgZ[13]等类型。在硬骨鱼中,IgM较其他类型的免疫球蛋白在含量上占绝对优势[14-15],检测IgM成为判断特异性免疫形成的标志之一。
疫苗主要分为传统疫苗和基因工程疫苗。传统疫苗分为灭活疫苗和减毒活疫苗(live attenuated vaccine, LAV),基因工程疫苗分为DNA疫苗、重组亚单位疫苗及活载体疫苗[16]。传统疫苗制备简易、成本较低、免疫效果优异,是市场主流。灭活疫苗较减毒活疫苗更加安全,且便于保存;减毒活疫苗接种量更小,但免疫持续时间长,也有一定的开发优势。常规灭活疫苗虽然激发了显著的抗体水平,但因为抗体不能有效进入感染细胞杀灭病原菌,无法提供有效保护;而减毒活疫苗进入宿主体内后,到达靶器官的方式与自然感染途径类似,且持续表达抗原,能有效刺激宿主细胞免疫应答,提高宿主清除感染细胞的能力,是该菌疫苗发展的重要方向[17]。
尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)是重要的经济养殖鱼类,海南是我国主要的罗非鱼养殖地,曾发生过以维氏气单胞菌为主要病原菌的爆发疾病案例[18]。目前针对维氏气单胞菌的疫苗相对空白,并且现有的嗜水气单胞菌疫苗和杀鲑气单胞菌疫苗对维氏气单胞菌的免疫效果不佳,制备维氏气单胞菌特异性疫苗迫在眉睫。为了展开针对维氏气单胞菌疫苗的研发,本实验构建了维氏气单胞菌ΔexsA1敲除株,检测了其毒力表达与免疫原性,为维氏气单胞菌疫苗的制备奠定实验基础。
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维氏气单胞菌野生株及ΔexsA1敲除株、大肠杆菌WM3064,具体见表1。
菌株或质粒 Strain or plasmid 基因型或表型 Genotype or phenotype 来源 Source 维氏气单胞菌野生株 野生型,分离自发病鱼体 实验室保存 维氏气单胞菌 ΔexsA1敲除株 exsA1基因缺失菌株 本研究构建 大肠杆菌WM3064 野生型,用于感受态制备 实验室保存 质粒Plasmid 自杀质粒pRE112 穿梭质粒,含sacB基因,氯霉素(Cm)抗性 实验室保存 Table 1. Bacterial strains and plasmids used for test
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尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)鱼苗购自海南宝路水产科技有限公司文笔峰养殖基地,养殖至实验用大小,规格为(10±1)g和(50±1)g。
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限制性核酸内切酶及其Buffer缓冲液购自NEB公司;T4 DNA Ligase及其Buffer缓冲液购自Monad公司; Rapid Taq Master Mix (2×)、Phanta Max Master Mix、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit等皆购自Vazyme公司;罗非鱼免疫球蛋白M(IgM)酶联免疫分析试剂盒测定购自江苏酶免实业有限公司。培养基(酵母提取粉、胰蛋白胨、琼脂糖、琼脂粉)购自Oxoid公司;二氨基庚二酸(Dap)购自Sigma公司;氯霉素购自北京索莱宝科技有限公司;各种无机盐等购自西陇科学股份有限公司;氨苄青霉素(Amp)购自上海源叶生物科技有限公司。
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分析exsA1基因及其上下游基因,选择上下游同源臂并设计其敲除扩增引物exsA1-F1/R1、exsA1-F2/R2和敲除验证引物exsA1-F0/R0;在敲除扩增引物中添加内切酶BstXI酶切位点,并在该位点中间添加限制性内切酶KpnI和SacI的识别序列,两同源臂之间添加EcoR I的酶切位点(表2)。提取维氏气单胞菌基因组,用敲除引物扩增上下游同源臂并纯化回收。将上下游同源臂片段用BstXI和EcoR I酶切,pRE112质粒用KpnI和SacI酶切,并连接得到重组质粒,再将连接产物电转进入大肠杆菌WM3064感受态细胞中复苏培养,菌落PCR验证,筛选出阳性菌株。将筛选到的阳性菌株和维氏气单胞菌野生株分别培养至对数期,再按照(1∶2)、(1∶3)和(3∶1)的比例混合为1 mL,6 000 r·min−1离心3 min后,留30 μL菌液滴入无抗的Dap的LB平板上,30 ℃培养30 h,将重组质粒利用双亲接合的方式转入维氏气单胞菌野生株中。取50 μL接合后,将菌液涂布于50 μg·mL−1氨苄青霉素、50 μg·mL−1氯霉素的LB平板上,30 ℃培养过夜。菌落PCR验证是否是维氏气单胞菌、是否有重组质粒。将阳性菌株通过8%蔗糖筛选,挑取筛选后的单菌落,使用敲除验证引物exsA1-F0/R0菌落PCR验证,对得到的阳性菌株用敲除引物进行PCR扩增,对产物进行了切胶回收后送样测序。
引物名称 Primer 引物序列 Primer sequences A.veronii C4-F ATGGTCGCAGAGCTTGTC A.veronii C4-R CAGCACAATAGAACACCAGAC exsA1-F1 CTGCAGAACCAGGTACCTGGCACACCATTAAGTCTGAGTC exsA1-R1 CTGCAGAACCAGAATTCTGGGAATCTGCGTGTAGTACCAG exsA1-F2 CTGCAGAACCAGAATTCTGGCCAGGTCGAGCGGTTGCAAC exsA1-R2 CTGCAGAACCAGAGCTCTGGCTGTGCCGTGTCGGGCACGG exsA1-F0 CTGCTTGTGACTGTTGTAGG exsA1-R0 GCTATGCCTTGCTCATCTTG pRE112-F ACATAGCCCCACTGTTCGT pRE112-R TTTTCGTCTCAGCCAATCC Table 2. Nucleotide sequences of primers used for construction of deletion mutants
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分别挑取维氏气单胞菌野生株和ΔexsA1敲除株单菌落,置于含有5 mL LB液体培养基的试管中,30 ℃、200 r·min−1过夜培养。紫外分光光度计中测定其OD600值,然后将各菌株菌液稀释至106 CFU·mL−1,分别吸取100 μL稀释液于96孔板相应位置,无菌新鲜的LB液体培养基作为对照。将96孔板置于多功能酶标仪中,设置程序:温度恒定30 ℃,持续振板,共测定36 h,每30 min测定1次OD600值。
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将维氏气单胞菌野生株和ΔexsA1敲除株单菌落接种于5 mL LB液体培养基中,30 ℃、200 r·min−1过夜培养,紫外分光光度计中测定其OD600值后,取OD600=1的菌液,6 000 r·min−1离心3 min后去上清,用无菌的0.9%生理盐水重悬,定容至2×108 CFU·mL−1,即为感染液。感染方法:将罗非鱼养殖到(10±1)g后,每组平均分20条。接种感染液,按照10 μL·g−1体质量的注射量对罗非鱼进行腹腔注射攻毒。持续观察1周,统计各组每天的死亡数。
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选取长势和大小相近(50±1)g的罗非鱼,平均分为3组,即空白对照组、野生株感染组和ΔexsA1敲除株感染组,并适应性饲养1周。将维氏气单胞菌野生株和ΔexsA1敲除株单菌落接种于LB液体培养基过夜培养后,配置成上述感染液并稀释10倍,得2×107 CFU·mL−1菌液。对罗非鱼进行腹腔注射攻毒实验,无菌0.9%生理盐水为对照。9天后再次攻毒同一组罗非鱼,分别在攻毒后第2天、第4天和第6天抽取罗非鱼血液。将血液室温静置30 min,2 000 r·min−1离心20min,吸取上清(罗非鱼血清)装入干净1.5 mL EP管中,−20 ℃保存备用。采用罗非鱼免疫球蛋白M(IgM)酶联免疫分析试剂盒测定罗非鱼血清中IgM含量。试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中IgM水平。固相抗原先与IgM结合,再与HRP标记的抗原结合,形成抗原−抗体−酶标抗原复合物,最后加底物TMB显色。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中IgM浓度。
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将罗非鱼养殖到(10±1)g后,分为攻毒对照组、减毒株接种组和接种对照组,每组40条。培养维氏气单胞菌ΔexsA1敲除株,配置成浓度为2×107 CFU·mL−1的注射液。按照10 μL·g−1体质量的注射量对罗非鱼进行腹腔注射,接种对照组注射无菌0.9%生理盐水。9 d后重复上述接种步骤。2次免疫注射结束后,用2×109 CFU·mL−1的野生菌株攻毒减毒株接种组和接种对照组,同等接种量的无菌生理盐水接种攻毒对照组,记录各组罗非鱼每天的死亡个数,计算累计死亡率。