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丙氨酸脱氢酶（alanine dehydrogenase，ALD，EC 1.4.1.1）是一种氧化还原酶，使丙氨酸可逆转化为丙酮酸[1]。编码ALD的基因为ald基因。结核分枝杆菌（M.tuberculosis）的ald基因在E. coli中表达后具有丙酮酸胺化活性；而当ald基因在M. tuberculosis中失活时，会导致细菌ALD活性丧失[2]。因此，ald基因是微生物中ALD活性必需的[1]。丙氨酸脱氢酶在自然界中分布广泛，存在于细菌、植物和真核藻类中，在微生物的氮、碳代谢中起重要作用[3]。ALD将脱氨/胺化作用与核苷酸辅因子(NAD+)的还原/氧化联系起来，从而与微生物中多种能量消耗/产生过程相关[4]。丙氨酸脱氢酶在孢子形成过程中以L−丙氨酸为主要能源，通过柠檬酸循环供应能量[5]，同时参与固氮作用（氨同化），确保生物体内氮源充足[6-7]，也可以平衡机体内的糖代谢和氨基酸代谢[8]。此外，丙氨酸脱氢酶作为新的抑制剂靶标也具有特殊的医学意义[9]，抑制ALD会导致肽聚糖层合成所需的L−丙氨酸不足，从而阻碍致病细菌的生长[10]。因此，基于丙氨酸脱氢酶的生物学特性开发的生物抑菌剂，能够对细菌尤其是致病菌的生长产生一定的抑制作用[11]。
维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是一种革兰氏阴性菌，广泛存在于自然环境中，是感染鱼类的最常见致病菌之一。目前已证实，维氏气单胞菌可感染罗非鱼、斑点叉尾、草鱼等20多种水生生物，病鱼主要有脏器出血、严重腹水等症状[12]。此外，维氏气单胞菌还能够感染狐、熊猫等哺乳动物，导致其精神沉郁，肠胃炎，肝脏病变[13]。该菌也可以导致人类疾病，人食用了被污染的水产品和畜禽产品后，可引发腹泻、脑膜炎和败血症等，免疫力低下者甚至死亡[14]。因此，维氏气单胞菌被定义为一种人−兽−鱼共患的致病菌，从而引起人们的警惕与重视。为了后续在维氏气单胞菌中开展ALD相关研究，开发潜在特异性抑菌剂，笔者通过基因重组技术成功构建Flag-ALD融合表达质粒，在大肠杆菌表达体系中对其进行诱导表达，并通过SDS-PAGE和western blot技术检测外源表达蛋白。本研究构建的重组载体为后续进一步探究ALD蛋白在维氏气单胞菌中的调控功能夯实了基础，有利于揭示丙氨酸脱氢酶在各种代谢调控通路中起的关键作用。以ALD为新的切入点，有助于揭示维氏气单胞菌的致病机制，为预防和治疗由该病原菌引起的水产病害提供新的途径和思路。
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本实验用的菌株与质粒见表1。
实验材料 Burst material 相关属性 Related attributes 来源 Source 菌株
StrainsE. coli BL21 野生型，用于表达外源蛋白表达 实验室保存 E. coli DH5α 野生型，用于质粒克隆 实验室保存 Aeromonas veronii 野生型，分离自发病鱼体 实验室保存 质粒
PlasmidspACYDuet 大肠杆菌蛋白表达载体，含有左霉素抗性基因 实验室保存 pACYDuet-Flag-ald pACYDuet重组质粒，包含T7启动子和维氏气单胞菌融合Flag标签的 ald 基因 本实验构建 Table 1. Strains and plasmids used in this study
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限制性核酸内切酶NcoⅠ，EcoRⅠ和T4DNA连接酶选购自美国NEB公司；2×PhantaMaxMaster Mix，DL5000 DNA Marke、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自中国Vazyme公司；双色预染蛋白Mark、5×蛋白质加样缓冲液购自中国生工公司；用于Western blot的anti-Flag抗体、山羊抗小鼠lgG H&L（Alexa Fluor ®488）购自美国abcam公司；其他试剂均为国产分析纯。
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把维氏气单胞菌C4的基因组DNA作为模板，用引物对Flag-ALD-F/ALD-R扩增ald目的基因（Flag-ALD-F：5′-CATGCCATGGGCGATTACAAGGATGACGACGATAAGATGATTATCGGTGTACCTAA-3′；ALD-R：5′-CGGAATTCTCAGTTCAGCAGGGTCAGGG-3′）。PCR反应体系为50 μL，体系包括：上下游引物各1 μL，模板1 μL，2×PCR mix25 μL，ddH2O 22 μL。PCR扩增条件为：预变性94 ℃ 10 min，变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 80 s，总计循环30次，终延伸72 ℃ 10 min，4 ℃停止反应。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离检测，对目的条带进行割胶纯化回收。
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将纯化后的目的片段与pACYCDuet空载质粒分别用限制性核酸内切酶NcoⅠ与EcoRⅠ进行双酶切处理，酶切体系为50 μL，包括：内切酶NcoⅠ和EcoRⅠ各1 μL，Cutsmart缓冲液5 μL，目的基因和质粒各600 ng，ddH2O 30 μL。将酶切产物用试剂盒纯化回收并用T4 DNA连接酶放在22 ℃金属浴中连接30 min，连接体系包括：pACYCDuet质粒30 ng，目的基因90 ng，T4 DNA连接酶1 μL，Cutsmart缓冲液1 μL，ddH2O 10 μL。将连接产物电转化至已经制备好的E. coli DH5α感受态细胞内，将转化细菌在37 ℃复苏1 h后涂布到含25 mg·L−1左霉素的LB固体培养基上，37 ℃恒温培养过夜后，挑取转化子的单菌落至LB培养基中振荡培养，提取质粒。用载体特异性引物对pACYCDuet-F/pACYCDuet-R进行菌落PCR（pACYCDuet-F：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；pACYCDuet-R：5′-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′），以验证阳性转化子，将验证正确的阳性转化子送至上海生工生物工程有限公司测序。
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将测序成功的pACYCDuet-Flag-ald重组载体电转化至E. coli BL21感受态中，挑取单菌落至含25 mg·L−1 氯霉素的5 mL LB培养基中37 ℃恒温振荡培养12 h。将其菌液按初始OD600值为0.01的接种量转接到200 mL LB培养基中（含25 mg·L−1氯霉素），37 ℃培养至OD600值为0.4时加入终浓度0.1 mmol·L−1的异丙基−β−D−1−硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导外源蛋白大量表达，每隔1 h取菌液，6 000 r·min−1离心10 min收集菌体，在收集的菌体中加入50 μL 1×蛋白上样缓冲液（250 mmol·L−1 Tris-HCl，pH 6.8，10%SDS，0.5%溴酚蓝，50%甘油，7.5%DTT），吹打混匀后，100 ℃金属浴20 min，13 000 r·min−1离心10 min，分离上清和沉淀。向沉淀中加入20 μL 1×蛋白加样缓冲液，吹打混匀后，100 ℃水浴锅20 min。各取10 μL上清和沉淀蛋白提取液，用12%SDS-PAGE凝胶进行电泳分析，考马斯亮蓝R-250染色1 h显示电泳结果。
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将含有外源表达蛋白的细胞全蛋白提取物通过12%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，在250 mA的恒定电流下通过湿转法转膜90 min，将全蛋白提取物转移到NC膜上。用5%脱脂奶粉封闭液（10 mmol·L−1 Tris-HCI，100 mmol·L−1 NaCl，25 mmol·L−1 NaF，0.1%Tween-20，pH7.4）室温封闭硝酸纤维素膜3 h，然后用anti-Flag抗体4 ℃孵育过夜，TBST (10 mmol·L−1 Tris-HCI，135 mmol·L−1 NaCl，2.5 mmol·L−1 KCI，0.1%Tween-20，pH 7.4)洗膜3次，每次10 min，之后用荧光标记的山羊抗小鼠lgG H&L（Alexa Fluor ®488）避光常温孵育2 h，1X TBST洗膜3次，每次10 min，最后在Typhoon FLA 9500（GE，USA）多功能激光扫描仪上扫描荧光标记的NC膜，检测目的蛋白表达情况。
1.1. 实验材料
1.2. 实验试剂
1.3. Flag-ald 目的基因的扩增及纯化
1.4. pACYCDuet-Flag-ald 重组载体构建
1.5. Flag-ALD融合蛋白的诱导表达及Western blot分析
1.5.1. Flag-ALD融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE凝胶电泳分析
1.5.2. Western blot分析
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为了便于检测在E. coli中大量表达的ALD蛋白，笔者在ald基因N端融合Flag标签，通过检测Flag标签来验证ALD蛋白的表达。E. coli BL21是常用的大肠杆菌工程菌株，通常与含有T7启动子的质粒搭档，用于诱导蛋白的过量表达。从图1可知，本实验选择pACYCDuet载体在E. coli BL21中表达Flag-ALD蛋白，质粒含有T7启动子，经IPTG诱导可大量表达目标蛋白。
Figure 1. The plasmid profiles of pACYCDuet and pACYCDuet-Flag-ALD
Flag标签含有8个氨基酸，核苷酸序列为24 bp，将其核苷酸序列并入用于扩增ald基因的上游引物的5'端，经PCR扩增即可获得Flag-ALD融合片段。ald基因序列长度为1 116 bp，则编码Flag-ALD融合片段的核苷酸序列理论长度为1 140 bp。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示，大约1 100 bp处存在1条明亮单一的目的条带，可用于后续实验（图2A）。通过割胶回收纯化PCR产物后，与pACYCDuet空载体均用限制性核酸内切酶NcoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，并对酶切产物进行纯化回收。对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析（图2B），从图2B可知，酶切后的目的片段长度在1 000～1 500 bp之间（泳道1），酶切后载体的泳动速度比酶切之前载体的泳动速度慢（泳道2和泳道3），表明载体已被成功酶切，可用于后续实验。
Figure 2. PCR amplification of ALD gene (A) and double restriction digestion of the target gene and pACYCDuet plasmid (B)
通过酶切连接构建融合表达载体pACYCDuet-Flag-ald，将其电转化至E. coli DH5α 感受态中，并通过含25 mg·L−1 左霉素的抗性平板筛选阳性克隆。挑取候选阳性克隆菌落，以其为模板进行菌液PCR，以验证阳性转化子。菌液PCR结果表明，以阳性克隆载体为模板，能够扩增获得大约1 000 bp的目的产物（图3，泳道1和3）。从阳性转化子中提取质粒，由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果表明，重组载体构建成功。
Figure 3. Identification of positive clones by bacterial PCR
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将测序结果正确的融合表达载体电转化至E. coli BL21中，加入0.1 mmol·L−1 IPTG诱导目的蛋白表达。用热裂解法裂解细菌，超速离心后，分别收集上清液和沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，对凝胶进行考马斯亮蓝染色后观察，从图4可知，与没有添加IPTG诱导组（泳道1）相比，加入IPTG诱导2 h后，菌体裂解上清液在位于约42 kD处（泳道3）出现显著的目的蛋白条带（图4箭头所示），而沉淀中没有观察到目的蛋白表达（泳道2），表明融合蛋白Flag-ALD以可溶性形式成功表达。
Figure 4. Induced expression of the fusion protein Flag-ALD
为了探索IPTG诱导的最佳时间，每隔1 h取1次菌液，用热裂解法裂解细菌，离心后取上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，随后考马斯亮蓝染色，结果表明（图5），与未添加IPTG的组（泳道1）相比，加入IPTG诱导后（泳道2～5），伴随着诱导时间增加，诱导表达的目的蛋白浓度逐渐增加（箭头所示），且诱导3 h后即使诱导时长增加，蛋白表达量也保持大致相同。
Figure 5. Effect of IPTG-based inducing time on the expression of target protein
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用anti-Flag抗体对携带Flag标签的靶标蛋白进行Western blot，结果在42 kD处检测到1条特异条带（图6），Flag-ALD融合蛋白的相对分子质量为41.8 kD，Western blot结果与预期相符，说明Flag-ALD目的蛋白已经成功表达。
Figure 6. Detection of the expression of Flag-ALD fusion protein by Western blot
2.1. pACYCDuet-Flag-ald 表达载体构建及鉴定
2.2. 融合蛋白Flag-ALD诱导表达
2.3. Western blot鉴定Flag-ALD蛋白的表达
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维氏气单胞菌是一种新型的人、鱼共患的病原菌，致病性强，可导致广泛的水生生物感染，对水源生物和人类健康存在一定的危害[13]。因此，研究维氏气单胞菌的致病机制，寻找抑制剂靶标，研究新型抑菌剂变得尤为重要。丙氨酸脱氢酶是一种生理酶，ALD在微生物体内的主要作用为产生丙氨酸[15]，为肽聚糖的合成提供原料[16]。研究表明，巨大芽孢杆菌[17]和嗜碱性假坚强芽孢杆菌[18] OF4中的ALD蛋白都曾在大肠杆菌中外源表达，通过基因克隆技术构建原核表达载体pET-OF4Ald，经硫酸铵分级沉淀、分子筛柱层析等方法获得纯化后蛋白。上述研究为维氏气单胞菌来源的ALD蛋白在大肠杆菌中外源表达提供了理论基础，但均未对外源蛋白进行标记，需要使用较为复杂的纯化方法，而且也不利于后续直接检测外源蛋白的表达
本实验以维氏气单胞菌的丙氨酸脱氢酶为研究对象，通过分子克隆获得Flag-ALD融合表达载体，并在大肠杆菌中大量表达该蛋白。由于ALD的单克隆抗体没有商品化且制备周期较长，为了方便ALD蛋白的检测，本研究采取的策略是在其N端融合Flag标签，通过检测Flag标签就可以反映ALD蛋白在大肠杆菌中表达的表达情况。选择Flag标签作为融合标签是因为Flag标签全长8个氨基酸，分子质量不大，对目的蛋白的空间结构和表达没有影响，且anti-Flag抗体较常见，易获得。通过SDS-PAGE凝胶电泳分析可知，得到的重组蛋白ALD以可溶性蛋白的形式存在，菌体裂解后的沉淀中基本不含目的蛋白。通过对诱导蛋白表达条件的改良可知，在加入0.1 mmol·L−1 IPTG诱导3 h后，目的蛋白的表达量基本达到最大，这为后续实验需大量表达目的蛋白提供了最佳表达条件。本研究获得的ALD外源表达蛋白，可用于开发生物抑菌剂，以酶蛋白为靶标，开发合适的抑菌剂从而有效地抑制细菌滋生，为开发病原菌维氏气单胞菌的生物抑制剂提供了新的切入点。同时，也为病原菌的致病机制及病害防治提供了一条研究途径。
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