ATAF2 positively contributes to the disease resistance against Oidium heveae in Arabidopsis

拟南芥野生型Col-0、拟南芥突变体ataf2-1（SALK_136355）^[12]、拟南芥ataf2-2（SALK_015750）^[12]、拟南芥突变体eds1^[13] (eds1-2，快中子轰击基因缺失突变体)等植物材料。橡胶树白粉菌菌株Oidium heveae HN1106^[11]。

将生长了5周的拟南芥放入40 cm×40 cm 50 μm尼龙膜接种箱中，利用毛笔刷把橡胶树白粉菌刷到尼龙膜上，进行接种。10 d后，对拟南芥叶片发病症状进行观察并拍照。剪取叶片，进行脱色过夜（脱色液为V_乙醇∶V_苯酚∶V_水∶V_乳酸=2∶1∶1∶1）。将脱色后的叶片在考马斯亮蓝染色液（G250 6 g·L⁻¹乙醇溶液）中染色30 s，显微镜观察，计数单个孢子产生的分生孢子数。

液氮预冷研钵，放入拟南芥叶片，反复加入液氮，研磨3次。加入1 mL Invitrogen Trizol (Lot No. 66223)溶液，提取拟南芥叶片总RNA。加入DNA酶，37 ℃消化1 h后，利用Invitrogen公司的RNA反转录试剂盒III (Lot No. 696045)进行反转录。采用SYBR^®Premix Ex TaqⅡ(Lot No. AK2702)试剂盒进行荧光定量PCR，PCR采用20 μL反应体系，PCR程序：95 ℃ 40 s，95 ℃ 6 s，62 ℃ 40 s，40个循环。PCR引物 ACTIN：5′-TGGTGGAAGCACAGAAGTTG-3′；5′-GATCCATGTTTGGCTCCTTC-3′，ATAF2F：5′-ACGGACGAGGAGCTTGTGAA-3′；ATAF2 R：5′-CTCCGGTAGCTTTCCAATAAC-3′。

利用氯化铯密度梯度离心的方法提取XopD-FLAG，ATAF2-FLAG和EDS1-HA质粒。制备拟南芥Col-0的原生质体，于原生质中分别转化ATAF2-FLAG和EDS1-HA的混合质粒各60 μg以及XopD-FLAG和EDS1-HA的混合质粒各60 μg作为对照，弱光下过夜培养。100 g离心2 min，弃去上清，与原生质体沉淀中加入1 mL蛋白提取缓冲液（0.15 mol∙L⁻¹ KCl，50 m mol∙L⁻¹ HEPES-KOH pH7.5，1 mmol∙L⁻¹ EDTA，1 mmol∙L⁻¹ DTT，0.2% Triton-X 100，cocktail蛋白酶抑制剂）提取原生质体总蛋白。然后分别加入anti-Flag M2 agarose (sigma) 20 μL。4 ℃孵育4 h。500 g离心1 min，弃去上清，沉淀用1 mL漂洗缓冲液（0.15 mol∙L⁻¹ KCl，50 mmol∙L⁻¹ HEPES-KOH pH7.5，1 mmol∙L⁻¹ EDTA，1 mmol∙L⁻¹ DTT，0.5% Triton-X 100，cocktail蛋白酶抑制剂）漂洗6次后，加入洗脱缓冲液（0.5 mmol∙L⁻¹ 3XFLAG多肽）50 μL，4 ℃孵育1 h。离心，取上清进行SDA-PAGE电泳，分别用FLAG抗体和HA抗体检测蛋白相互作用。

分别将GST-ATAF2和GST与HIS-EDS1各50 μg混合于2个1.5 mL离心管中，用缓冲液[0.025 mol∙L⁻¹ Tris-HCl (pH7.5), 0.1 mol∙L⁻¹ NaCl，0.001 mol∙L⁻¹ DTT]定容至1 mL，4 ℃孵育0.5 h。然后再分别加入50 μL Glutathione Sepharose^TM4B, 4 ℃孵育1 h。500 g离心1 min，弃去上清，沉淀用1 mL漂洗缓冲液[0.025 mol∙L⁻¹ Tris-HCl (pH7.5)；0.1 mol∙L⁻¹ NaCl；0.001 mol∙L⁻¹ DTT；0.2% Triton-X 100]反复清洗离心，洗涤5次。最后加入100 μL洗脱缓冲液（10 mmol∙L⁻¹还原型谷胱甘肽、50 mmol∙L⁻¹ pH8.0 Tris-HCl），4 ℃孵育10 min。离心，取上清进行SDS-PAGE电泳，分别用立春红染色和HIS抗体检测相互作用。

通过在拟南芥野生型Col-0上接种Oidium heveae HN1106，进行RNA-seq数据分析。接种后4 d，发现拟南芥NAC家族转录因子ATAF2上调表达6倍。为了验证该结果的准确性，对培养约5周的拟南芥野生型Col-0接种Oidium heveae HN1106，分别剪取接种后0，2，4，8 d的拟南芥野生型Col-0的叶片，提取总RNA，进行反转录和荧光定量PCR试验。结果表明，在接种后2 d，ATAF2基因大约上调表达5倍（图1），在接种后4 d上调20倍（图1），接种后8 d上调表达15倍（图1），表达趋势与RNA-seq数据一致，表明ATAF2基因受橡胶树白粉菌诱导上调表达。

Figure 1.  The ATAF2 gene expression was up-regulated by the inoculation of Oidium heveae in Arabidopsis

文献[12]报道了ATAF2参与调控拟南芥对腐生真菌的抗病性。且ATAF2基因在接种橡胶树白粉菌后发生明显上调表达（图1），为此，笔者推测ATAF2可能参与了拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性的调控。为了验证该可能性，笔者获得了ataf2 T-DNA插入纯和系拟南芥突变体ataf2-1和ataf2-2，并且在拟南芥野生型Col-0，拟南芥突变体ataf2和拟南芥突变体eds1上接种橡胶树白粉菌。接种10 d后发现，野生型拟南芥出现明显的抗病发黄的表型（图2A），而拟南芥突变体eds1表现出明显的白粉病病斑（图2A），拟南芥突变体ataf2-1和ataf2-2出现了微弱的白粉病病斑（图2A）。进一步通过分生孢子计数分析，橡胶树白粉菌不能在野生型上产生分生孢子，在突变体ataf2上产生了少量的分生孢子（图2B），eds1上形成了大量的分生孢子（图2B）。综上结果表明，ataf2突变体表现出对橡胶树白粉菌感病的表型。

Figure 2.  ATAF2 positively contributed to the resistance against Oidium heveae in Arabidopsis

橡胶树白粉菌在拟南芥上激发抗病性依赖于EDS1，因此，笔者推测ATAF2可能参与了EDS1的抗病信号通路，二者在植物体内可能发生相互作用。为了验证二者是否在植物体内相互作用，笔者构建了带有FLAG标签的ATAF2和带有HA标签的EDS1原生质体表达载体。通过氯化铯密度梯度离心提取质粒后，共同转化拟南芥原生质体，黄单胞菌XOPD蛋白作为对照，进行免疫共沉淀实验。实验结果表明，ATAF2可以与EDS1发生相互作用，而对照蛋白XOPD则不能发生相互作用（图3Ⅰ）。为了进一步验证二者是否直接相互作用，笔者构建了GST-ATAF2蛋白和HIS-EDS1蛋白原核表达载体。转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导蛋白表达，分别纯化GST，GST-ATAF2和HIS-EDS1蛋白，进行pull down实验。免疫印迹结果表明，GST-ATAF2可以与HIS-EDS1发生相互作用，而对照GST则不能相互作用，暗示着ATAF2与EDS1是直接相互作用（图3Ⅱ）。

Figure 3.  ATAF2 directly interacts with EDS1 in vivo and in vitro

笔者通过筛选橡胶树白粉菌接种拟南芥后的上下调基因，发现NAC家族转录因子ATAF2基因受橡胶树白粉菌的诱导上调表达，并且参与了拟南芥对白粉菌的抗病性的调控。笔者进一步通过蛋白质相互作用证实ATAF2与EDS1发生相互作用。文献[14-15]报道，ATAF2作为转录激活或抑制因子，在植物抗逆，光合作用以及激素合成等方面发挥非常重要的作用_，但EDS1与ATAF2的互作机制，以及二者在抗病信号通路中的上、下游关系还需要进一步从遗传上证明。在拟南芥植物体内，存在着超过90个NAC家族的转录因子^[12]。通过接种橡胶树白粉菌的实验，笔者发现与拟南芥eds1突变体相比，拟南芥ataf2突变体表现出部分抗性缺失的表型，表明其他的同类型转录因子可能也参与了拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性的调控，但具体是哪些蛋白参与，还需要进一步筛选。文献[12]报道ATAF2受病原菌的诱导表达，负调控拟南芥对尖孢镰刀菌的抗病性。然而，在笔者的实验中，发现ATAF2受橡胶树白粉菌的诱导表达，正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性。因此，ATAF2对2个不同病原菌的抗性作用机制可能是不一样的，但具体的作用机制，还需进一步探索。