Optimization of Genomic DNA Extraction for Conus litteratus

信号芋螺（Conus litteratus)活体采自中国南海海域(N15°46′～17°08′，E111°11′～112°54′)，于−80 ℃超低温冰箱保存（图1A），将冷冻的信号芋螺置于冰上30 min，待微解冻后破壳，解剖，分别取出毒腺、毒管、腹足以及肝胰脏（图1B）4种组织待用。

Figure 1.  Conus litteratus and the tissues of their different organs

磁珠法动物基因组DNA抽提试剂盒（B518721）和改良的DNA快速提取试剂盒（B518221）均购于上海生工公司；FastPure Tissue DNA提取试剂盒（DC102）购于诺唯赞公司；海洋动物组织DNA提取试剂盒（DP324）购于天根公司。2×Taq PCR Master Mix（天根生化科技有限公司）；4S Red Plus核酸染色剂（生工生物工程有限公司）；琼脂糖、6×Loading Buffer, 10×Loading Buffer（北京索莱宝科技有限公司）；DL15000 DNAMarker，DL5000 DNAMarker（南京诺唯赞公司）。

所用仪器（品牌）主要有：琼脂糖水平电泳仪(Bio-Rad)，高速冷冻离心机(HITACHI)，PCR扩增仪(Eppendorf Mastercycler X50)，低温循环水浴锅(Polyscience)，凝胶成像系统(Protein-Simple)，NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo)等。

称取毒腺20 mg、毒管10 mg、腹足20 mg及肝胰脏10 mg，冰上剪碎，分别置于研钵中用液氮研磨成粉末，加入1.5 mL的离心管中，然后向离心管中加入200 μL Buffer MCL，400 μL Buffer MACL和20 μL Proteinase K（PK），上下颠倒混匀，稍离心，65 ℃水浴30～40 min。期间，多次颠倒混匀，待溶液基本澄清，取出离心管，12 000 r·min⁻¹离心5～10 min，小心吸取上清液500 μL至新的1.5 mL的离心管中；加入20 μL RNase (10 g·L ⁻¹)溶液，混匀，室温放置5 min。加入500 μL Buffer MA和15 μL MagicMag Beads（MMB），MMB加到液面以下，且尽量将枪头上残留的MMB吸干净，混匀，室温静置1 min。将离心管置于磁力架上30 s，待MMB完全吸壁后，吸弃上清，取下离心管；加700 μL 70%乙醇，颠倒混匀，置于磁力架上30 s，吸弃上清，重复1次。室温开盖干燥或者55 ℃恒温箱开盖干燥至管内无液体；向离心管中加入50 μL TE Buffer（pH8.0），65 ℃水浴5～10 min，混匀；取出离心管置于磁力架上30 s，小心吸取上清至新的离心管，即得基因组DNA。

组织处理如1.3，加入400 μL buffer Digestion和20 μL PK，振荡混匀；65 ℃水浴1 h至溶液变澄清透明,否则可适当延长裂解时间;水浴后加入20 μL RNase（10 g·L⁻¹）溶液，颠倒混匀，室温放置5 min；加入200 μLBuffer PA，充分颠倒混匀，置于20 ℃冰箱5 min后室温10 000 r·min⁻¹离心5 min，吸取500 μL上清液到新的离心管中（若上清液浑浊，可加等体积的氯仿混匀，12 000 r·min⁻¹离心取上清）；加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀，于−20 ℃放置20 min，10 000 r·min⁻¹离心5 min，弃上清；用1 mL 75%乙醇漂洗2 min，10 000 r·min⁻¹离心2 min，取上清，重复1次，漂洗时一定要使沉淀悬浮起来；开盖室温倒置至残留乙醇完全挥发，肉眼可见DNA沉淀变成半透明状，离心管内无乙醇味道即可；干燥完成后用50 μL TE Buffer（pH8.0）溶解即得DNA。

组织处理如1.3，加入230 μL Buffer GA和20 μL PK，涡旋混匀，55 ℃水浴至组织完全酶解；加入20 μL RNase (10 g·L⁻¹)溶液，颠倒混匀，室温放置5 min；若消化液比较浑浊或存在明显的颗粒，则10 000 r·min⁻¹离心3 min，转移上清液至新的离心管中；加入250 μl Buffer GB，充分涡旋混匀，70 ℃水浴10 min；加入250 μL无水乙醇，涡旋混匀；将gDNA Columns吸附柱置于收集管中；将上步所得的混合液转移到吸附柱中，10 000 r·min⁻¹离心1 min；弃滤液，用500 μL Washing Buffer A洗涤1次，10 000 r·min⁻¹离心1 min，650 μL Washing Buffer B洗涤2次，弃滤液，空管离心2 min；将吸附柱置于新的1.5 mL离心管中，加50 μL预热至70 ℃的Elution Buffer至吸附柱的膜中央，室温放置3 min，10 000 r·min⁻¹离心1 min；弃掉吸附柱，离心管中即为DNA。

组织处理如1.3，加入200 μL GA涡旋振荡15 s；加入20 μL RNase (10 g·L⁻¹)混匀，放置5 min。加入20 μL PK，涡旋混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；56 ℃水浴30 min，待溶液变澄清透明后加入200 μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，会产生一些白色沉淀，70 ℃放置10 min，溶液变清亮；加入200 μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀；将吸附柱CB3放入收集管中，将上步所得溶液和沉淀都加入吸附柱中，12 000 r·min⁻¹离心30 s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；加入500 μL缓冲液GD，12 000 r·min⁻¹离心30 s，弃废液；再用600 μL漂洗液PW漂洗2次，12 000 r·min⁻¹离心30 s，弃废液，将吸附柱放入收集管中，空管离心2 min；将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液；将吸附柱放入新的1.5 mL的离心管中，向吸附柱中央悬空滴加50 μL 洗脱缓冲液TE，室温放置5 min，12 000 r·min⁻¹离心2 min，离心管中所得即为DNA。

取DNA溶液1 μL，通过NanoDrop 2000紫外分光光度计检测DNA的浓度和吸光度，并根据组织用量，计算DNA的产率。再取9 μL DNA溶液，加1 μL的10×Loading Buffer用于凝胶电泳检测，TAE缓冲液，制1%的胶，电压90 V，电泳时间30 min，用于观察样品的相对分子质量大小。

以芋螺核基因DNA上α−芋螺毒素基因设计引物，F: 5′-GTGGTTCTGGGTCCAGCA-3′, R: 5′-GTCGTGGTTCAGAGGGTC-3′；正向引物根据内含子的保守序列设计，反向引物则是根据3′-UTR设计（图2），4种方法所提的DNA为模板，判断所提DNA是否为核基因组DNA，该PCR反应体系为：25 μL: 2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，补加ddH₂O至25 μL。反应条件：预变性，95 ℃，5 min；循环内：变性，95 ℃，30 s；退火，56 ℃，30 s；延伸，72 ℃，1 min，共30个循环；再延伸72 ℃，10 min。将所得PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，电压90 V，电泳时间30 min。

Figure 2.  Schematic diagram of primer design for α-conotoxin gene cloning

从表1可知，磁珠法DNA抽提试剂盒所提取的毒腺、毒管、腹足以及肝胰脏的A₂₆₀/A₂₈₀分别为1.69，2.01，1.73，1.61，其中，毒管和肝胰脏组织提取的纯度较低；改良的DNA快速提取试剂盒法的A₂₆₀/A₂₈₀分别为1.89，1.91，1.84，1.69，提取效果比磁珠法好，但肝胰脏有降解和蛋白污染等的问题；FastPure Tissue DNA提取试剂盒法的A₂₆₀/A₂₈₀分别为1.67，1.94，1.84，1.87，毒腺的A₂₆₀/A₂₈₀值偏低；海洋动物组织DNA提取试剂盒法的A₂₆₀/A₂₈₀分别为1.80，1.82，1.74，1.63，肝胰脏有明显的蛋白污染。比较4种方法的A₂₆₀/A₂₈₀可以看出，改良的DNA快速提取试剂盒提取的DNA纯度和海洋动物组织DNA提取试剂盒方法整体略优于其他2种方法，而且不同芋螺组织中，毒腺和腹足提取DNA的纯度更高。

从表1可知，改良的DNA快速提取试剂盒法整体优于其他试剂盒法，其中，毒管和肝胰脏组织的产率明显高于毒腺和腹足，腹足则略高于毒腺，结合A₂₆₀/A₂₈₀数值，4种方法提取腹足的基因组DNA纯度最高，A₂₆₀/A₂₈₀数值均接近1.80，因此，改良的DNA快速提取试剂盒法提取腹足组织能够获得较高纯度且较高产率的DNA（图3）。

Figure 3.  Yield of genomic DNA extracted from different organs with four different kits（*=P<0.01）

将4种方法提取的不同组织的基因组DNA进行水平电泳检测（图4），从电泳条带看，条带均比较清晰。其中，改良的DNA快速提取试剂盒法电泳图中，毒腺，腹足提取的DNA条带明亮且清晰，大小均超过15 kb，DNA完整性较好且不存在明显污染情况；而毒管和肝胰脏DNA则完整性较差，条带弥散，且肝胰脏泳道最下方有明亮的条带，应是RNA污染，此结果在提取肝胰脏中较为常见，毒管泳道最下方也有模糊条带，可见毒管也有RNA污染的问题，毒腺和腹足组织DNA无明显的污染条带，此结果和NanoDrop 2000检测结果相符。这可能是由于毒腺和腹足密度较大，组织无法研磨充分，阻碍了蛋白质溶解，故而裂解过程比较困难，影响了DNA的产率。肝胰脏最易研磨，故而产率最高，但是由于其组织过于柔软，且富含DNA酶，在冷冻、解剖、以及提取过程中可能造成其DNA降解，故而电泳条带多呈现弥散状。

Figure 4.  Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of Conus litteratus different tissues extracted with four different kits

通过4种试剂盒的电泳图（图4）可以发现，毒管和肝胰脏的DNA的降解严重，纯度低，对比毒腺与腹足的DNA产率，腹足略优于毒腺，况且毒腺组织材料相对少，不适用于大量提取DNA，所以腹足是更为合适的提取组织，且从图中（图3）可发现，提取腹足DNA时，改良的DNA快速试剂盒提取的DNA产率最高，因此，改良的DNA快速提取盒法提取腹足的DNA产率高、完整性好、纯度高。提取信号芋螺的腹足基因组DNA用该方法更合适。

以芋螺核基因特有的A超家族的α−芋螺毒素基因为引物，4种不同的方法提取的DNA为模板进行PCR，电泳发现1～16泳道均有明亮的条带，大小在100～250 bp之间（图5），与芋螺毒素的前体基因相符，测序后确定目的条带为α−芋螺毒素基因，大小为167～170 bp。因此，所提取的DNA可用于后续实验。

Figure 5.  Electrophoresis of PCR amplified products of α-conotoxin precursor genes

DNA提取试剂盒种类繁多，应用方法多样，其中，包括吸附材料结合法（材料包括磁珠、硅质材料和阴离子交换树脂等）、浓盐法、阴离子去污剂法以及苯酚抽提法等。试剂盒提取DNA的操作过程大多比较简单，一般用时约1 h，组织用量为1～100 mg，其主要步骤包括匀浆，裂解细胞释放DNA，去除蛋白和其它杂质，纯化和DNA洗脱^[21]。不同组织处理方式和提取的效果也不同，其中，芋螺的毒腺，腹足因富含胶原蛋白需要用液氮研磨，肝胰脏则因为富含DNA酶也需要用液氮充分研磨至粉末，并且尽量减少暴露在空气中的时间以减少降解。组织的裂解情况会直接影响到DNA的提取质量，这4种试剂盒在加入裂解液后，水浴30～60 min，此时研磨的粉末都应完全裂解，溶液清澈透明，但在实验过程中，磁珠法试剂盒和DNA快速提取试剂盒在水解1 h后仍然有颗粒状悬浮物。笔者在多次尝试后发现，减少组织用量（毒腺、腹足和肌肉的用量低于20 mg，肝胰脏用量低于10 mg时），裂解情况明显改善；另外，在DNA快速提取试剂盒的裂解液中加入20 μL蛋白酶K，其裂解情况明显改善，最后所提的DNA产率和纯度都有明显的增加；延长裂解时间也有利于组织的裂解，但时间过长（>3 h），会导致DNA产率及纯度的下降。裂解之后的操作原理主要是利用在特定的环境里，核酸能与相应的介质结合，洗涤后将杂质去除，通过更改溶液环境，确保DNA在TE Buffer中溶解^[21]。如磁珠法顾名思义是用磁珠吸附DNA，然后用70%乙醇洗涤，此法不涉及有毒性试剂，也不用离心，较适用于自动化操作中；FastPure Tissue DNA提取试剂盒法和海洋动物组织DNA提取试剂盒法均是用滤膜离心柱法，使DNA吸附于硅胶柱上，离心去除杂质，此法主要是离心操作，比较简便；DNA快速提取法是利用DNA在异丙醇中溶解度低的原理，用异丙醇沉淀DNA，操作简单。溶解DNA时用加热至70 ℃TE Buffer，能更好地获取DNA。

迄今为止，已有很多提取芋螺DNA优化方法，如丁青等^[22]比较了CTAB法、磁珠法和离心柱法提取菖蒲芋螺（Conus vexillum）3种不同组织器官的DNA的的效果，结果发现，CTAB法在提取大片段DNA时更有效，更适于构建大片段DNA文库，但此法操作比较复杂，且需要使用氯仿等有毒试剂；罗素兰等^[23]采用苯酚-蛋白酶k法、缠绕法、快速分离法和改良苯酚-SDS法从6种不同芋螺中提取总DNA，建立了较优化的芋螺DNA提取方法，但这些方法提取腹足组织时很难得到DNA，且不能有效去除蛋白质，因而不适合用来提取腹足DNA。笔者对DNA快速试剂盒进行改良（减少组织用量，裂解时加入蛋白酶K，沉淀DNA时在−20 ℃冰箱中放置20 min），发现用腹足的部位提取的DNA纯度高，产率大，并且因为腹足组织多且易获得，因此，可以用来提取芋螺DNA。