Establishment and optimization of genetic transformation system based on RUBY visual reporting system for pepper hairy roots

本研究所用辣椒品种为‘茄门’，购自沧州津科力丰种苗有限责任公司。

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株Ar Qual（CAT：AC1060）、K599（CAT：AC1080）、MSU440（CAT：AC1070）以及35S::RUBY质粒（PL1245）均购于上海唯地生物技术有限公司，其抗性标记特征见表1。

在超净工作台中，将种子置于体积分数75%乙醇浸泡1 min，随后在体积分数15% NaClO溶液中摇晃浸泡15 min，完成表面消毒。无菌水冲洗种子3～5次，随即接种于MS固体培养基上，28℃暗培养5 d。后移至（24±2）℃、光周期为L︰D=16 h︰8 h的生长室进行培养。待辣椒苗的子叶充分展开、生长点露出后，即获得无菌苗。

取出发根农杆菌感受态细胞，冰上融化，每100 µL感受态加入1 µg 35S::RUBY质粒，混匀，依次于冰上静置5 min，液氮5 min，37℃水浴5 min，冰上放置5 min。室温下加入700 µL无抗生素的TY液体培养基，220 r·min⁻¹振荡培养2 h。6000 rpm离心1 min，弃上清，重悬菌体，涂布于含有50 µg·mL⁻¹ spec抗生素的TY平板上，28℃倒置培养2～3 d。挑取单克隆置于含spec抗生素的TY液体培养基中过夜振荡培养。基于载体序列设计RUBY引物（F: 5’-GACAGCCGAGACAGACCAAA-3’，R: 5’-TCCCAGGAGGAGTGGATCAG-3’）对菌液进行PCR扩增，得到441 bp条带的为阳性克隆，用50%甘油低温保存。

取20 µL甘油保存的阳性克隆菌液，接种于5 mL LB液体培养基（含100 µg· mL⁻¹ spec），220 r·min⁻¹振荡培养20 h，按照1︰200比例加入100 mL LB液体培养基（含100 µg·mL⁻¹ spec）中培养24 h。将所得菌液以6000 r·min⁻¹离心10 min，弃上清，重悬于液体MS培养基中（含100 µmol·L AS），室温静置3 h，得到农杆菌侵染液。

选取两叶一心无菌苗，于子叶节下方2～3 cm处切除根系。本研究采用单因素试验，依次优化发根农杆菌菌株、菌液OD₆₀₀（0.2、0.4、0.6）、侵染时间（10、20、30 min）、共培养时间（1、2、3 d）。开展某一因素优化时，其余固定参数参考茄科作物毛状根相关文献^[15-16]，并结合本实验前期预实验结果设置，基础固定条件为OD₆₀₀=0.4，侵染时间20 min，共培养2 d。将去根苗浸泡在农杆菌侵染液中10、20、30 min，用无菌滤纸吸干去根苗表面菌液，转移至MS共培养培养基（含100 µmol·L ⁻¹ AS），室温暗培养1～3 d。共培养结束后，用无菌水清洗5～6次，无菌滤纸吸干去根苗表面水分，转移至毛状根诱导培养基（MS+100 µmol·L AS+400 mg·L⁻¹特美汀），20 d后统计毛状根诱导效率。

选取毛状根，使用Aidlab New Type Plant DNA试剂盒（DN15）提取DNA。利用基于质粒序列设计的引物进行PCR扩增。rolB引物（F: 5'-ACTATAGCAAACCCCTCCTGC-3'，R: 5'-TTCAGGTTTACTGCAGCAGGC-3'），扩增出652 bp条带的样本，可确定为毛状根。RUBY引物同1.2.2，能扩增出441 bp条带的样本，可确认为转入了35S::RUBY载体的阳性毛状根。

每个处理设置3次生物学重复，每次生物学重复不少于30个外植体。采用Excel 2021整理原始试验数据，采用IBM SPSS Statistics 26对辣椒不同外植体毛状根诱导率、毛状根阳性率数据进行单因素方差分析（ANOVA），并采用Duncan多重比较法进行组间差异显著性检验（以P<0.05作为差异显著判断阈值）。

利用发根农杆菌菌液浸泡法侵染幼苗诱导毛状根，主要流程如图1所示。去根幼苗与发根农杆菌菌液共培养后，侵染位点可见显著膨大（图1-A）；转至发根诱导培养基10 d后，切口处开始形成毛状根（图1-B）；继续生长至20 d，子叶也观察到有肉眼明显可见的红色毛状根（图1-C）。

Figure 1.  Construction of the hairy roots genetic transformation system of pepper

分别提取去根苗和子叶的毛状根DNA进行PCR检测，以转入35S::RUBY质粒的MSU440菌株作为阳性对照，以未侵染的根系、未转入35S::RUBY质粒的MSU440菌株和H₂O作为阴性对照（图1-D）。结果显示，检测的红色与白色根系均能扩增出652 bp的rolB基因片段，提示长出的根系均为发根农杆菌侵染导致的毛状根。而红色毛状根能扩增出441 bp的RUBY基因片段，白色毛状根却无法扩增出该基因片段，说明毛状根显示出来的红色可以作为遗传转化成功的标志。

在菌液OD₆₀₀=0.4、侵染时间30 min、培养时间2 d的条件下，比较Ar Qual、K599、MSU440发根农杆菌对2种外植体的转化效果，得出不同发根农杆菌菌株对辣椒毛状根的诱导和转化效率均存在一定差异（图2）。在去根苗的毛状根诱导率方面，Ar Qual与MSU440菌株的诱导率皆为100%，显著高于K599的85.16%（图2-A）。然而，从毛状根遗传转化效率方面来看，K599的阳性率（15.53%）显著高于Ar Qual（8.76%）和MSU440（8.43%）（图2-B）。综合诱导率和阳性率数据，可以推断K599菌株比较适合用于辣椒去根苗的毛状根遗传转化试验。

Figure 2.  Effects of different Agrobacterium strains on hairy roots induction rate and transformation positive rate of pepper explants

在子叶的毛状根诱导率方面，MSU440菌株的诱导率最高（9.21%），K599和Ar Qual的诱导率均低于5%，三者之间均存在显著差异（图2-C）。从毛状根遗传转化效率方面来看，Ar Qual的阳性率（78.70%）高于K599（60.32%）和MSU440（58.78%）（图2-D）。综合诱导率和阳性率数据，可以推断MSU440菌株比较适合用于子叶的毛状根遗传转化试验。

不同外植体选取各自最优菌株，设置菌液浓度OD₆₀₀为0.2、0.4、0.6 3个梯度，得出不同菌液浓度对辣椒毛状根的诱导和转化效率均存在一定差异（图3）。在去根苗的毛状根诱导率方面，OD₆₀₀为0.4的诱导率（97.87%）显著高于OD₆₀₀为0.6（92.57%），OD₆₀₀为0.2与二者差异不显著（图3-A）。然而，从毛状根转化效率方面来看，阳性率随菌液浓度升高呈上升趋势，其中OD₆₀₀为0.6时阳性率最高（15.02%），显著高于OD₆₀₀为0.2（8.79%）和0.4（9.99%）的阳性率（图3-B）。由此可见，OD₆₀₀为0.6的菌液浓度比较适合用于去根苗的毛状根遗传转化试验。

Figure 3.  Effects of different bacterial suspension concentrations on hairy roots induction rate and transformation positive rate of pepper explants

子叶的毛状根诱导率整体极低（<10%），仅在OD₆₀₀为0.2浓度下略高，为7.22%（图3-C）。在阳性率检测中，3种浓度下的毛状根阳性率均维持在60%～70%，无显著差异（图3-D）。基于以上数据，OD₆₀₀为0.2的菌液浓度比较适合用于子叶的毛状根遗传转化试验。

不同外植体选取各自最优菌株及菌液浓度，设置10、20、30 min 3个侵染时间梯度，得出不同侵染时间对辣椒毛状根的诱导和转化效率均存在一定差异（图4）。在去根苗的毛状根诱导率方面，侵染10 min（98.09%）与30 min（96.58%）的诱导率显著高于侵染20 min（90.50%）（图4-A）；从毛状根转化效率方面来看，30 min的阳性率（14.11%）高于10 min（9.01%）和20 min（7.78%）（图4-B），但无显著差异。由此可见，侵染时间30 min比较适合用于去根苗的毛状根遗传转化试验。

Figure 4.  Effects of different infection time on hairy roots induction rate and transformation positive rate of pepper explants

在子叶的毛状根诱导率方面，整体维持在极低水平，各时间点之间也无显著差异（图4-C）。从毛状根转化效率方面来看，20 min的阳性率（75%）高于10 min（62.80%）和30 min（60%），但无显著差异（图4-D），基于诱导率和阳性率数据，侵染时间为10 min比较适合用于子叶的毛状根遗传转化试验。

不同外植体选取各自最优菌株、菌液浓度和侵染时间，设置1、2、3 d 3个共培养时间梯度，得出不同共培养时间对辣椒毛状根的诱导和转化效率均存在一定差异（图5）。在去根苗的毛状根诱导率方面，3种共培养时间下的根诱导率均稳定在90%以上，无显著差异（图5-A）；然而，从毛状根转化效率方面来看，共培养3 d时阳性率最高（16.16%），显著高于1 d（7.69%）和2 d（8.17%）（图5-B），由此可见，共培养3 d比较适合用于去根苗的毛状根遗传转化试验。

Figure 5.  Effects of different co-culture time on hairy roots induction rate and transformation positive rate of pepper explants

在子叶的毛状根诱导率方面，3种共培养时间下，子叶诱导率整体维持在极低水平（<7%），无显著差异（图5-C）；从毛状根转化效率方面来看，共培养2 d的阳性率最高（81.26%），高于1 d（55.69%）和3 d（60.86%）（图5-D），但无显著差异，综合子叶的诱导率和阳性率，共培养2 d比较适合用于子叶的毛状根遗传转化试验。

不同外植体对发根农杆菌的响应存在明显差异。本研究中，去根苗伤口处较早产生大量毛状根，而子叶产生毛状根时间较晚，且诱导率不足10%。这可能与根茎分生细胞分裂活性强、毛状根发生速度快有关，导致外源基因与Rol基因共同转入细胞的时间窗口较短，因此去根苗阳性率相对较低。子叶分化程度高，发根形成条件更严格，反而为外源基因整合提供了更充足的时间，故其阳性率较高。类似现象在杨树（Populus tremula × P. alba）、马铃薯（Solanum tuberosum L.）和苜蓿（Medicago sativa L.）等植物中也有报道，说明外植体类型是影响转化效率的重要因素^[17-19]。

菌株类型同样显著影响转化效率。本研究中，Ar Qual和MSU440对去根苗的毛状根诱导率均显著高于K599，但K599的阳性率最高。这可能与K599携带的pRi2659质粒有关，其T-DNA片段更易整合到植物基因组中^{[20, 21]}。此外，K599对地下组织可能具有偏好性，而MSU440对子叶的转化效率相对较高，反映出不同菌株对辣椒不同组织的侵染特异性^[22]。

菌液浓度是决定农杆菌侵染效率的关键参数。本研究中，去根苗的毛状根诱导率在3种菌液浓度下均维持在90%以上，说明辣椒去根苗对菌液浓度具有一定耐受性。OD₆₀₀=0.6时阳性率最高，表明适宜的高浓度菌液可在保证侵染活力的同时，避免过度伤害外植体。类似结果在拟南芥（Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.）、尾巨桉（Eucalyptus urophylla × E. grandis）等植物中也有报道，但不同物种所需菌液浓度差异较大^{[23- 24]}。

侵染时间影响农杆菌在植物组织表面的附着量及侵染深度，共培养时间则影响T-DNA的转移、整合及表达。本研究中，10～30 min侵染时间均能维持去根苗90%以上的毛状根诱导率，而子叶诱导率始终低于10%，说明去根苗对侵染时间适应性较强，子叶则难以被有效侵染。共培养3 d时去根苗阳性率显著高于1 d和2 d，表明充足的共培养时间有利于T-DNA转移和整合；但超过3 d会增加染菌风险，因此本试验设置最长共培养时间为3 d。该结果与苦瓜（Momordica charantia L.）、杜梨（Pyrus betulifolia Bunge）、彩色马蹄莲（Zantedeschia hybrida）等植物中“侵染30 min＋共培养3 d”的较优参数组合基本一致^[25-27]。

与传统GFP、GUS等报告基因相比，RUBY表达产物可产生肉眼可见的红色色素，无需复杂检测步骤即可快速筛选阳性毛状根，且阳性率与PCR鉴定结果完全吻合。该优势显著简化了转化体系筛选流程，提高了工作效率，已在水稻（Oryza sativa L.）、矮牵牛（Petunia × hybrida）、柠檬（Citrus × limon（L.）Osbeck）等植物中验证了其应用潜力^[28-30]。

本研究初步构建了发根农杆菌介导的辣椒毛状根遗传转化体系，得出以去根苗为外植体时，选用K599菌株、菌液OD₆₀₀=0.6、侵染30 min、共培养3 d，遗传转化阳性率可达16%左右。但本研究采用单因素试验，仅能获得单因素条件下的较优参数组合，无法解析菌株、菌液浓度、侵染时间、共培养时间之间的交互效应。后续可基于本研究筛选得到的参数区间，进一步开展正交试验或响应面分析，解析因子间的协同或拮抗作用，提升辣椒毛状根转化效率。此外，还可进一步优化共培养温度、AS浓度、培养基激素配比，并尝试子叶节、下胚轴等不同外植体，或结合真空、超声波等辅助处理，为辣椒转化体系优化提供更多方向。本研究目前仅获得转基因阳性毛状根，尚未实现由阳性毛状根再生成完整辣椒再生植株，因此该体系适合开展辣椒根部相关基因的快速功能验证。后续还需进一步优化分化再生条件，尝试从阳性毛状根获得完整转基因再生植株。

本研究构建了基于RUBY可视化报告系统的去根苗外植体辣椒毛状根遗传转化体系，并依次开展了菌株、菌液浓度、侵染时间、共培养时间条件的初步优化。在以去根苗为外植体的情况下，采用菌株K599、菌液浓度OD₆₀₀为0.6、根部侵染30 min、共培养3 d的培养条件，能达到约16%的毛状根阳性率。在以子叶为外植体的情况下，采用菌株MSU440、菌液浓度OD₆₀₀为0.2、根部侵染10 min、共培养2 d，能达到相对较高的毛状根阳性率。然而，在现有条件下，子叶的毛状根诱导率不足10%，尚未建立稳定可用的毛状根遗传转化体系，需要进一步予以优化。综上所述，本研究为发根农杆菌介导的辣椒根部基因功能验证提供了一定的技术平台。