Effects of flower development and environmental factors on pollen viability and stigma receptivity in Camellia drupifera

供试材料为树龄4～5年、长势健壮且无病虫害的‘海油2号’与‘海油4号’越南油茶植株，株行距为3 m × 4 m，种植于海南省农业科学院热带园艺研究所苗圃（20°0′35″ N, 110°21′28″ E）。试验地属热带季风气候，年均气温23.8 °C，年均降水量1 691 mm，年日照时数2 060 h。试验于2024年11—12月越南油茶盛花期（田间开花率25%～75%）开展，2个品种各选取10株长势均匀、健康无损伤的单株作为试验样树，保证试验样本一致性与试验结果可靠性。

结合油茶花芽分化过程和越南油茶雄蕊发育规律，本试验取‘海油2号’花开前5 d至花开后30 h的花粉，以分析花发育进程对花粉活力的影响^[25-26]。花发育进程共选择15个时间节点，分别是：花开前5 d（−120 h）、花开前4 d（-96 h）、花开前3 d（−72 h）、花开前2 d（−48 h）、花开前1 d（−24 h）、花开时（0 h）、花开2 h、花开4 h、花开6 h、花开8 h、花开12 h、花开24 h、花开26 h、花开28 h和花开30 h。15个时间节点的花粉均于晴天采集，花开前参照花芽分化特征确认花蕾时间节点^[26]，花开时和花开后采用挂牌法标记花开时间节点（图1）。在田间条件下，于早上7点，选取花瓣微张花药未裂的花苞进行挂牌标记而后根据时间节点采样。为防止昆虫传播其他花粉，对标记后的花套上纱网袋隔离花粉，同时记录采集时间。采集各时间节点花粉后，立即制作花粉显微观察载玻片并做好标记。随后，迅速把制作好的花粉样品载玻片带回试验室置于恒温培养箱中培养（温度25 °C，相对湿度80%），培养结束后用显微镜观察统计花粉萌发率，以衡量花粉活力。花粉活力统计采用花粉萌发率法，通过离体培养和显微观察，用显微镜观察并统计‘海油2号’花粉的萌发率^[25,27]。在含0.005 g·L⁻¹硼酸和100.00 g·L⁻¹蔗糖的液体培养基中，离体培养越南油茶花粉。离体培养花粉时，取100 μL液体培养基置于凹形载玻片，散布花粉后轻柔搅拌，培养4 h后，用Nikon Eclipse Ci-L显微镜（10倍放大倍数）观察花粉萌发情况。各试验处理，至少显微观察5个视野，各视野花粉粒数量大于50粒，花粉管长度大于花粉自身直径时视作萌发。记录各视野中花粉粒总数和萌发花粉粒数量，计算花粉萌发率（萌发花粉粒数/总花粉粒数×100%）以衡量花粉活力，花粉萌发率越高表明花粉活力越强。各花粉萌发率统计试验都设置3个独立重复。

Figure 1.  Fower development in Camellia drupifera

本试验在实验室条件下开展，探究温度、模拟降雨、光照强度对越南油茶花粉活力的影响，以花粉萌发率作为花粉活力评价指标。于盛花期采集‘海油 2 号’花开前 1 d（−24 h）的花蕾枝条带回实验室水培（图1），通过设置梯度处理，分析上述环境因子对花粉活力的作用规律。除特殊说明外，试验均在 740-FHC 型光照培养箱（HiPoint）内进行，花粉离体培养基础条件设定：温度 25℃，相对湿度 80%，光合光子通量密度（PPFD）800 μmol·m⁻²·s⁻¹。

温度处理试验：设置 0、4、10、15、20、25、30、35℃共 8 个温度梯度。将水培枝条置于恒温培养箱内培养至花蕾开放，花朵开放 2 h 后采集花粉，立即开展离体培养，显微观测并统计花粉萌发率。

模拟降雨试验：待水培枝条上花蕾花瓣微张时，采用配备单孔喷嘴的按压喷壶喷施天然雨水模拟降雨；喷施压力 0.28 MPa，雾滴中位粒径 73.24 μm。单次持续喷施 10 min，间隔 5 min，连续喷施 3 次。分别于降雨结束即刻（0 h）及降雨后 2、4、6、24 h 采集花粉，显微测定花粉萌发率。

光照强度试验：在光照培养箱内利用不同规格遮阳网构建 4 组光照梯度：对照组（无遮光，PPFD≈800 μmol·m⁻²·s⁻¹）、3 针遮阳网（遮光率 50%，PPFD≈400 μmol·m⁻²·s⁻¹）、6 针遮阳网（遮光率 75%，PPFD≈200 μmol·m⁻²·s⁻¹）、10 针遮阳网（遮光率 95%，PPFD≈40 μmol·m⁻²·s⁻¹）。花朵开放 2 h 后收集花粉，进行离体萌发测定，花粉萌发率统计方法同 1.2 节。

为探究花发育进程对越南油茶柱头可授性的影响，本试验以母本品种‘海油4号’为材料，于盛花期依据花柱发育状态，设置花开前5 d至花开后48 h共14个观测时间节点，包括花开前−120、−96、−72、−48、−24 h、花开当时（0 h）及花开后2、6、12、24、28、30、36、48 h，各时间节点判定标准与花粉活力测定试验一致（图1）。

田间选定各时间节点花朵后，立即人工去雄，统一授以‘海油2号’花开2 h的新鲜成熟花粉，授粉后迅速套袋隔离，杜绝外源花粉污染。所有去雄与授粉操作均在晴天完成，并全程佩戴手套、口罩以保证试验洁净。授粉24 h后采集各处理花柱，投入固定液保存并编号，用于后续花粉管荧光显微观测。

参照苯胺蓝荧光染色法测定柱头可授性^[7,9-10]，具体操作如下：花柱样品经无水乙醇−冰醋酸（体积比3∶1）固定12 h，转入70%乙醇中于4℃低温保存。观测前取出样品，采用8 mol·L⁻¹ NaOH溶液软化4 h，蒸馏水冲洗5～7次；随后在避光条件下，置于含0.15 mol·L⁻¹ 磷酸氢二钠的0.5%酸性苯胺蓝染色液中染色4 h。染色完毕后常规制片，采用Nikon Eclipse Ci-L正置荧光显微镜观察、拍照，利用ImageJ软件统计花柱内花粉管数量，以此评价柱头可授性强弱。

试验每处理设置3次生物学重复，每次重复观测15朵授粉花朵，保证数据稳定性与可靠性。

温度、降雨和光照强度等环境因素对越南油茶柱头可授性的影响试验，同样在实验室条件下完成（光照培养箱条件同1.3部分）。温度对‘海油4号’柱头可授性影响试验，设置0，4，10，15，20，25，30和35 °C等8个处理。在各培养温度，分批水培‘海油4号’带有花开前1 d花蕾的枝条，花刚开时（花瓣微张花药未裂）开展去除雄蕊和人工授粉试验。继续原温度培养24 h后，分别收集各处理授粉花柱，置于固定液中，用于显微观察统计花粉管数量。模拟降雨和光照强度对柱头可授性的影响试验处理，同上述模拟降雨和光照强度对花粉活力影响试验。取模拟降雨刚完成（0 h）、降雨后2 h、降雨后4 h、降雨后6 h和降雨后24 h等5个时间节点的花，去除雄蕊后，分别授上‘海油2号’花开2 h的成熟花粉。取4个不同光照强度处理下的花，去除雄蕊后，分别授上‘海油2号’花开2 h的成熟花粉。人工授粉完成后，继续培养授粉花柱24 h，取各处理授粉花柱，置于固定液中，用于显微观察统计花粉管数量。

在Excel 2021中，完成花粉萌发率和授粉花柱中花粉管数量的原始数据整理。数据间的方差分析，采用SAS（9.4）软件进行单因素方差分析，再使用Duncan法进行各处理不同水平之间的多重比较。各处理数据的表示使用平均值±标准差（SD），多重比较时，同一处理相同字母表示差异不显著（P>0.05），不同字母表示差异显著（P<0.05）。柱状图的绘制使用GraphPad Prism（8.0.2）软件。

花粉萌发率是衡量花粉活力的最直接指标，根据越南油茶花发育进程不同时期的花粉萌发率变化，可以直观展现其花粉活力的变化。在显微镜下，‘海油2号’萌发花粉的花粉管，十分清晰，而未萌发的花粉则无花粉管（图2），表明显微观察统计越南油茶花粉萌发率切实可行。如图2所示，花开前−120、−96、−72、−48、−24 h和花开后30 h等6个时间节点，花粉萌发率最低，几乎不萌发，都是0%；花刚开时（0 h）、花开后24、26、28 h等4个时间节点，花粉萌发率居中，萌发率介于1.58%～3.26%之间；花开后2、4、6、8、12 h等5个时间节点，花粉萌发率最高，萌发率在7.96%～9.82%之间。总结发现，花开前‘海油2号’花粉几乎不能萌发，以及花开后30 h完全散粉。因此花刚开时到花开后30 h，花粉萌发率呈现出先增加再减少直至最后花粉萌发率归零的趋势。多重比较结果显示，花开后2 h至花开后12 h范围内的5个时间节点，花粉萌发率显著高于（P<0.05）其余10个时间节点，表明这5个时间节点的花粉活力值最高，取该时间范围内的花粉用于授粉可保障授粉成功率。花刚开时以及花开后24～28 h时间范围内，花粉萌发率差异不显著（P>0.05），花粉萌发率较低，表明该时间段的花粉不太适合用于人工授粉。其他6个萌发率为0%时间节点的花粉，几乎不具有活力，不能用于人工授粉。

Figure 2.  Effects of floral developmental stage on pollen germination rate in Camellia drupifera

越南油茶花期，温度、降雨和光照强度等环境因子对正常授粉受精影响最大。在实验室条件下，通过不同试验处理，分析了温度、模拟降雨和光照强度等对越南油茶花粉活力的影响（表1）。在本研究设置的8个温度条件下，‘海油2号’花粉萌发率在0%～19.22%之间，其中0 °C时，花粉萌发率为0%，而20 °C时，花粉萌发率为19.22%。当温度为20，25和30 °C时，‘海油2号’花粉萌发率无显著差异（P>0.05）且显著高于（P<0.05）其余5个温度时的花粉萌发率。当温度为4，10和15 °C时，‘海油2号’花粉萌发率也无显著差异（P>0.05），位于次高水平。当温度为35 °C时，‘海油2号’花粉萌发率急剧下降至较低水平（< 4.00%）。当温度为0 °C时，‘海油2号’花粉几乎不萌发。这些结果表明，‘海油2号’花粉活力最高的温度区间是20～30 °C，当环境温度高于最适温度区间时，花粉活力会急剧下降，而环境温度低于最适温度区间时，花粉活力会梯度下降。在0～20 °C时，‘海油2号’花粉萌发率呈现出逐步增加的趋势，说明此温度区间随着温度的升高，花粉活力逐渐增加。在最适温度区间，培养和收集‘海油2号’花粉，花粉活力最高，可增加人工授粉的成功率。当温度低于或者高于最适温度区间时，培养和收集‘海油2号’花粉，花粉活力可能会降低甚至出现无活力的情况，不利于人工授粉。因此，在越南油茶人工授粉时，我们建议在最适温度区间范围内（20～25 °C）培养和收集花粉。

5个模拟降雨试验处理中，‘海油2号’花粉萌发率介于0%～6.33%之间，其中降雨后6 h花粉萌发率最高，降雨刚完成时（0 h）花粉萌发率最低，几乎不萌发。降雨后2 h，花粉萌发率略微上升至0.58%，表明此时花粉可能刚恢复萌发能力。降雨后2～6 h，‘海油2号’花粉萌发率逐渐升高，表明降雨对花粉萌发率的影响逐渐减小。降雨后24 h，‘海油2号’花粉萌发率下降且与降雨后4 h无显著差异（P>0.05），表明随着时间流逝降雨对花粉萌发率的影响逐渐减小但是花粉自身衰老可能也会降低花粉萌发率。此外，同样在25 °C水培花粉至成熟，模拟降雨处理后海油2号’花粉萌发率最高仅为6.33%，远低于正常水培的‘海油2号’花粉萌发率（16.59%）（图2），以及遮光处理的水培‘海油2号’花粉萌发率（11.00～16.56%）（表1）。这些结果证明，降雨会一定程度上导致越南油茶花粉活力下降。

光照强度的4个试验处理中，‘海油2号’花粉萌发率介于11.00～16.56%之间（表1）。0%遮光率、50%遮光率和75%遮光率的条件下，‘海油2号’花粉萌发率无显著差异（P>0.05），但是显著高于（P<0.05）95%遮光率的花粉萌发率，表明光照能一定程度上促进‘海油2号’花粉萌发，而黑暗处理能一定程度抑制花粉萌发率，越南油茶花粉萌发可能需要适宜光照强度。

雌蕊柱头是越南油茶接受花粉的关键器官。花粉落至柱头后，在柱头分泌黏液的诱导下萌发，花粉管沿花柱向子房定向伸长；花柱内观测到的花粉管数量可表征柱头可授性强弱。‘海油 4 号’花柱常 3 裂，具 3 枚柱头（图3-A）。人工授粉条件下，‘海油 2 号’成熟花粉可在‘海油 4 号’柱头萌发，花粉管向花柱基部、子房顶端生长；经苯胺蓝染色处理后，荧光显微镜下可清晰观察花粉管形态（图3-B）。

Figure 3.  Effects of flower development on stigma receptivity in Camellia drupifera

自花开前 5 d 至花开后 2 d 共 14 个时间节点的授粉样品中，均能检测到花粉管，说明该时段内‘海油 4 号’柱头持续具备可授性。由图3-C 可见，不同时期花柱内花粉管数量整体呈先上升、高位维持、随后快速下降的变化趋势。花开前 5 d 至花开后 2 h，花粉管数量逐步增多，柱头可授性持续提升；花开后 2～28 h，花柱内花粉管维持较高水平，对应柱头可授性较强；花开后 30～48 h，花粉管数量骤减，柱头可授性显著衰退。

花开后 6 h 花柱中花粉管数量达到峰值，该节点与花开后 2、12、24、28 h 无显著差异（P>0.05），但显著高于其余 9 个时间点。花开前 2 d、花开前 1 d、花开当日 0 h、花开后 30 h 花粉管数量处于次高水平；花开后 36 h、花开前 3 d、花开前 4 d、花开前 5 d 花粉管数量整体偏低；花开后 48 h 花柱内花粉管数量最低。

综上，‘海油 4 号’自花开前 5 d 即具备较弱柱头可授性；伴随花柱发育成熟，可授性逐步上升并达到峰值，在花开后 2～28 h 维持高可授水平；随花柱衰老，柱头可授性快速下降，至花开后 48 h 降至较低水平。

除影响花粉活力外，花期温度、降雨和光照强度等还是影响越南油茶柱头可授性的主要环境因子。为揭示这些环境因子对越南油茶柱头可授性的影响，我们在实验室条件下设置了不同试验处理。在设置的8个温度条件下，‘海油4号’授粉花柱中花粉管平均数量为5.43～20.03个（图4-A）。温度为15 °C时，‘海油4号’授粉花柱中花粉管数量最多（20.03个），而温度为0 °C时，‘海油4号’授粉花柱中花粉管数量最少（5.43个）。温度为15 °C时，‘海油4号’授粉花柱中花粉管数量显著高于（P<0.05）其余7个温度处理，表明此温度条件下‘海油4号’柱头可授性最高。温度为25 °C时，‘海油4号’授粉花柱中花粉管数量次高，与10、20和30 °C等3个温度处理无显著差异（P>0.05），但是却显著高于4、0和35 °C等3个温度处理，表明25、10、20和30 °C等4个处理中‘海油4号’柱头可授性较高。温度为0 °C和35 °C时，‘海油4号’授粉花柱中花粉管数量最少，且显著低于其余6个温度处理，表明此温度条件下‘海油4号’柱头可授性最低。总之，温度能够显著影响‘海油4号’柱头可授性。温度范围在10～30 °C之间时，‘海油4号’柱头可授性较高，能够保障较好的授粉成功率。当温度低于10 °C或者高于30 °C时，‘海油4号’柱头可授性会显著降低，从而不利于授粉受精。

Figure 4.  The effects of temperature, simulated rainfall, and light intensity on stigma receptivity in Camellia drupifera

在4个模拟降雨试验中，‘海油4号’授粉花柱中花粉管数量没有呈现出明显趋势性（图4-B）。模拟降雨后6 h，‘海油4号’授粉花柱中花粉管数量最多（17.72个），显著高于（P<0.05）模拟降雨后2 和4 h，但是与模拟降雨刚完成时（0 h，13.90个）无显著差异（P>0.05）。这些结果说明，降雨能够影响越南油茶的柱头可授性。降雨刚完成时，越南油茶柱头可授性略有降低但是达不到显著水平，随着雨水的作用，2 h后柱头可授性显著降低，6 h后恢复到较高水平。24 h后，虽然降雨影响较小但是花柱的衰老同样会降低柱头可授性。

在4个遮光处理试验中，‘海油4号’授粉花柱中花粉管数量介于10.25～15.50个之间，但是相互之间无显著差异（P>0.05）（图4-C），表明光照强度对越南油茶柱头可授性影响较小。0%遮光率时，‘海油4号’授粉花柱中花粉管数量最多，95%遮光率时，‘海油4号’授粉花柱中花粉管数量却最少，说明增加光照强度可略微提高越南油茶柱头可授性但是达不到显著水平。

越南油茶存在自交不亲和特性，必须接受异株花粉方可顺利完成授粉受精并坐果^[9]。自然栽培条件下，越南油茶花期集中于秋冬季，田间传粉昆虫活动受限，传粉效率偏低，长期存在自然坐果率不高、产量低下等生产难题^[28]。人工授粉是破解该瓶颈的有效技术手段。花粉活力与柱头可授性共同决定授粉成败，二者同步维持较高水平时开展人工授粉，能够显著提升授粉效率，促进坐果与产量形成。系统解析花发育进程对花粉活力、柱头可授性的调控规律，有助于确定最佳授粉窗口期；花期温度、降雨、光照等环境因子可通过调控雌雄蕊生理生化代谢，改变花粉活力与柱头可授性。厘清上述环境因子的作用特征，能够为越南油茶人工授粉适宜天气的选择提供理论依据。

现有油茶花粉活力与柱头可授性相关研究多集中于普通油茶^[18-29] 与小果油茶^[30]。花粉活力常用 TTC 染色法^[18,29-30]、花粉离体萌发法^[30] 测定；柱头可授性普遍采用联苯胺 - 过氧化氢法进行检测^[18,29-30]。本研究针对海南本地越南油茶开展相关研究，花粉活力采用离体培养法测定，柱头可授性采用人工授粉 — 花粉管荧光观察法评价^[31]。相较于传统检测手段，本研究选用方法更贴近田间真实授粉过程，试验结果可信度更高，可精准反映花发育进程、温度、降雨、光照对雌雄蕊育性的综合影响。以往普通油茶、小果油茶相关研究仅探讨花发育时序对花粉活力与柱头可授性的影响，尚未关注花期环境条件的调控效应。本研究同步解析花发育进程、温度、降雨与光照强度对海南越南油茶花粉活力和柱头可授性的影响，研究结果更契合热带气候条件下越南油茶开花授粉的实际特征。本试验结果表明，从花开前至花开后，‘海油 2 号’花粉活力与‘海油 4 号’柱头可授性均随花器官发育呈现规律性变化：花开前后 4～6 h 二者持续上升，随后维持一段高活性时期，后期快速衰退。海南越南油茶花粉活力与柱头可授性的动态变化趋势与普通油茶 ^[18,29-30]、小果油茶^[30] 基本一致。该变化模式可划分为生理成熟、活性维持、生理衰败 3 个阶段：成熟阶段花粉与柱头育性逐步上升；维持阶段保持较高水平；衰败阶段育性快速下降。该规律已在多个油茶品种中得到证实，程钦华等^[32]对江西 10 个普通油茶主栽品种的观测同样发现柱头活力呈 “先升后降” 的变化特征。从生理层面分析，开花成熟阶段花器官呼吸速率提升、相关酶活性增强，为花粉萌发与受精创造条件；衰老阶段细胞膜系统受损、酶活性衰减，最终造成育性快速下降。最新研究进一步证实，衰败阶段活性氧积累、抗氧化酶活性降低会抑制花粉管伸长，从生理代谢角度解释了育性衰退的内在机制^[33]。上述变化规律对越南油茶人工授粉实践具备重要指导价值。本研究观察到越南油茶柱头可授持续时间长于花粉活力，该特征可用于优化授粉时间，实现高活力花粉与高可授性柱头有效匹配，提升授粉成功率。现阶段越南油茶生殖生物学研究多聚焦花粉萌发条件与自交不亲和特征，针对花粉、柱头育性时序变化及其授粉调控机制仍有待深入挖掘。

温度是调控花粉萌发、柱头可授性的关键环境因子，不同树种雌雄蕊育性对应的适宜温度存在明显差异^[34-35]。适宜温度能够促进花粉与柱头内部酶促反应，有利于营养物质合成与转化^[30]。本研究结果显示，越南油茶花粉活力最适温度为 20℃，柱头可授性最适温度为 15℃；二者最适温度存在分化，但 10～30℃范围内花粉活力与柱头可授性均可维持较高水平，该温度区间适宜开展花粉采集与人工授粉。花粉与柱头最适温度不一致，推测与调控花粉萌发、柱头识别接受过程的关键酶具有不同温度阈值有关^[36]：催化花粉萌发的酶类在20℃活性最高，介导柱头接受花粉的酶类最适温度为 15℃。类似现象在苹果中亦有报道^[36]。花期降雨会改变花粉成熟与衰老进程，降低花粉活力。降雨显著提升环境湿度，相较于雌蕊花柱，花药与花粉对水分胁迫更加敏感。高湿条件抑制花药开裂、花粉扩散与花粉萌发，因此降雨对花粉活力的负面影响显著大于柱头可授性。蓝莓相关研究也证实，持续阴雨 3 d 后花粉活力降幅远高于柱头可授性；同时柱头在雨停后育性可一定程度恢复，而花粉活力下降具有不可逆特征^[37]。本研究发现，光照可提升越南油茶花粉活力，该现象在普通油茶中已有报道^[38]，其机制可能为光照通过提升花期积温间接促进花粉发育；但光照对柱头可授性无显著影响，说明越南油茶花粉对光照响应更敏感，晴朗天气开展人工授粉更利于依靠花粉活力提升授粉成效。此外，温度、降雨、光照还会影响传粉昆虫种群活动，阴雨低温天气下油茶林传粉昆虫数量锐减，有效传粉媒介不足也是油茶自然坐果率偏低的重要诱因^[12,30]。海南属于热带季风气候，越南油茶盛花期气温普遍处于10～30℃，与雌雄蕊育性适宜温度区间相匹配。降雨天气不仅降低环境温度，还会提高空气湿度、削弱光照，不利于维持较高花粉活力；晴朗天气温湿度适宜、光照充足，有利于花粉活力与柱头可授性保持高位。据此建议优先选择晴朗天气开展越南油茶花粉收集与人工授粉作业。

本研究系统分析花发育进程、花期温度、降雨、光照对越南油茶花粉活力与柱头可授性的影响，但环境因子相关试验在可控实验室条件下完成，难以还原田间复杂气象环境与多因子交互作用，存在一定局限性。同时试验材料仅选用‘海油 2 号’与‘海油 4 号’，尚未涵盖海南其他主推越南油茶品种与优良种质，材料代表性有限。后续研究可拓宽种质材料范围，开展多环境因子交互试验，并进一步解析越南油茶花粉活力与柱头可授性变化的分子调控通路，为热带地区越南油茶高效人工授粉体系构建提供更加完善的理论支撑。

越南油茶花粉活力与柱头可授性受花发育进程与花期温度、降雨、光照等环境因子共同调控。‘海油 2 号’花粉活力在花开后 2～12 h 达到峰值，‘海油 4 号’柱头可授性高值区间为花开后 2～28 h；二者高活性时段存在重叠，且柱头可授持续时间显著长于花粉活力。温度、降雨对花粉活力与柱头可授性均存在显著影响，降雨对花粉活力的抑制效应更强；光照能够提升花粉活力，但对柱头可授性无显著作用。结合海南热带季风气候特点，生产上宜选择晴朗天气开展花粉采集与人工授粉：花粉采集窗口期为花开后 2～12 h，人工授粉适宜时段为花开后 2～28 h；田间实操可安排上午 10:00—12:00 采集花粉，下午 15:00—17:00 实施人工授粉。