Spatiotemporal expression characteristics of the epilepsy-associated gene chd2 during zebrafish embryonic development.

本研究选用野生型AB品系斑马鱼（购自国家斑马鱼资源中心），于循环水养殖系统中饲养（28.5℃，pH7.4～7.5，光照:黑暗=14 h:10 h），每日3次投喂丰年虾幼体。取7～8月龄成鱼（雌雄比2:3）置于产卵缸内隔板分离，放入培养箱避光过夜，将培养箱温度调至30℃可预先刺激斑马鱼次日配对产卵，第二天拔板经过光照刺激后，斑马鱼雌雄体自然交配，30 min内收集受精卵，经灭菌水洗涤后置于E3培养液（28.5℃）中培养，自受精12 h后，每日用吸管吸掉死卵，并使用移液器吸除约2/3体积的旧培养液，保留少量原培养液以避免胚胎应激，随后缓慢加入等体积预平衡的含0.1%PTU（N-苯基硫脲，上海麦克林）新鲜培养液。PTU能抑制黑色素沉积。斑马鱼发育至目标时期后，以4%多聚甲醛固定，梯度甲醇脱水，-20℃保存备用。

Eastep® super总RNA提取试剂盒（普洛麦格北京生物技术有限公司），逆转录PCR（Hiscript ii Q RT supermix for qPCR+gDNA wiper），RT-qPCR（Novostart® Universal Fast SYBR qPCR supermix），普通PCR（2x Phanta Max master Mix，诺唯赞），PCR引物合成（擎科生物有限公司）、DNA序列测定（广州天一辉远基因科技有限公司）；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（碧云天）、DIG RNA Labeling Mix（Roche）；T7 RNA Polymerase（Roche）；Anti-Digoxigenin-AP（Roche）；NBT、BCIP染色剂（碧云天）；DNase I（NEB）。

通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载人、斑马鱼等物种的Chd2蛋白序列，进行同源性比较；利用InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）分析人与斑马鱼的Chd2结构域差异。选取10个代表性物种，用DNAMAN进行多序列比对，ESPript 3.2（https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）可视化。基于15个物种序列，用MEGA-X软件以邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，Bootstrap重复抽样1 000次评估分支可靠性。分别用NetSurfP-3.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetSurfP-3.0/）和SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）预测二级结构，SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）进行三级结构建模。

选取AB品系斑马鱼胚胎，于受精后4、8、12、24、48、72、96、120、144、168 h共10个时间点取样，每时期收集约50枚胚胎放置同一个离心管（混合样本），每时期收集约50枚胚胎放置同一个离心管（混合样本），同时收集3个平行的1.5 mL离心管。干冰速冻研磨后提取总RNA（NanoDrop检测），反转录合成cDNA。参考斑马鱼chd2序列（登录号XM_021467690.2），用SnapGene设计引物（正向：5′-CTACTGAAGGACAAGGGAGTG-3′；反向：5′-AGAAGGGACCACAGCTCTTTG-3′，产物142 bp）。另取成鱼10尾，0.01% MS-222（三卡因甲磺酸盐，福建渔夫宝）麻醉后无菌分离卵巢、肝脏、肾脏、肠道、肌肉、心脏、脑、眼、脊柱、鳃、精巢、鳔、鳍、皮肤共14种组织，液氮速冻，−80℃保存，按相同方法提取RNA并反转录，供qPCR检测组织表达分布。胚胎和成鱼都以β-actin为内参基因，以各时期cDNA为模板进行qPCR（20 μL反应体系：SYBR qPCR Supermix 10 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA模板2 μL，ddH₂O补足；95 °C 5 min、95 °C 10 s、60 °C 30 s，40个循环）。每样本设3次生物学重复，采用 2^（−ΔΔCt）法计算相对表达量，以受精后24 h样品和肌肉样品为对照组进行归一化，结果以3次生物学重复的均值和标准差（Mean ± SD） 表示，胚胎样本为同一批次雌雄鱼交配产卵的胚胎样本（n = 3），qPCR 结果展示表达趋势。

WISH探针制备^[13]，取受精后24 h的胚胎约50枚放置同一个离心管研磨，50枚胚胎为一个重复，提取总RNA并反转录为cDNA。参照chd2序列（XM_021467690.2）设计引物（正向：5′-GAACTCAGAGATTACCAGCTAG-3′；反向：5′-GCAGCCTGTGATTGGATCGAAAG-3′），5′端和3′引物前分别引入Pst I和Hind III酶切位点。PCR扩增（95℃ 3 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，35循环；72℃ 5 min），胶回收后连接含T7启动子的pBluescript II SK（−）载体，转化DH5α，测序验证。提取质粒经Pst I线性化，酚氯仿纯化。以T7 RNA聚合酶体外转录合成地高辛标记反义RNA探针（20 μL反应体系：Template DNA X μL（1μg）；10× tanscription buffer 2 μL；DIG-NTP Mix 2 μL；T7 RNA polymerase 2 μL；RNase Inhibitor 1 μL；ddH₂O补足），DNase I消化模板，LiCl/乙醇沉淀，80%乙醇洗涤，DEPC水溶解后−20℃保存。原位杂交：取受精后4、8、12、24、48、96、120、168 h的胚胎各20枚，4%多聚甲醛固定，甲醇脱水-20℃保存。复水后1×PBST洗涤，65℃预杂交3 h，加入探针65℃杂交过夜。次日洗涤后加anti-DIG-AP抗体4℃过夜；第3日洗涤，BCIP/NBT显色，显微镜观察拍照。

本研究qPCR实验结果使用GraphPad Prism 8.0统计软件进行数据分析，各发育时期及不同组织基因表达数据均设3次生物学重复，数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示。不同发育时期及不同组织间的表达量比较，均采用单因素方差分析（One-way ANOVA），并以 Tukey 法进行多重比较，以 p<0.05 为差异显著。

为解析Chd2蛋白结构特征，从数据库NCBI获取斑马鱼（XP_021323365.1，1 817 aa）与人（NP_001262.3，1 828 aa）Chd2蛋白序列。InterPro结构域分析显示（图1），二者除长度相近外，结构域组成也高度一致，均含两个串联Chromo结构域（橙色）、两个P-loop NTPase结构域（灰色）和一个C端功能未明确的DUF4208_2结构域（粉色）。此外，人Chd2蛋白具有CDH1/2 SANT-Helical linker结构域（蓝色）和HTH型SLIDE DNA结合结构域（紫色），二者共同构成 SANT-SLIDE DNA结合模块。与之对应，斑马鱼Chd2蛋白C端亦含有SANT-Helical linker结构域和HTH型SLIDE DNA结合结构域（图中均以紫色标注），提示Chd2蛋白在人与斑马鱼中具有高度相似的结构域组成。

Figure 1.  Domain comparison of human and zebrafish Chd2 proteins

为评估Chd2蛋白的进化保守性，获取斑马鱼（Danio rerio）、人（Homo sapiens）、大鼠（Rattus norvegicus）、黑猩猩（Pan troglodytes）、小鼠（Mus musculus）、猪（Sus scrofa）、牛（Bos taurus）、鸡（Gallus gallus）、剑尾鱼（Xiphophorus maculatus）及尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）等10个物种的Chd2蛋白序列，经DNAMAN多序列比对及ESPript 3.2可视化结果（图2）显示，斑马鱼Chd2蛋白与人、黑猩猩、小鼠及大鼠的Chd2蛋白同源性较高。成对相似性计算（表1）表明，亲缘近的物种一致性最高（人与黑猩猩99.07%，小鼠与大鼠96.99%），亲缘远的物种相似性仍维持较高水平（斑马鱼与人为74.42%，与鸡为74.86%）。以上结果证实Chd2蛋白在脊椎动物中高度保守，提示其具有重要生物学功能。

Figure 2.  Homology comparison of Chd2 proteins among different species

为明确Chd2蛋白在物种进化中的系统位置，本研究基于15个物种的Chd2蛋白序列构建了分子进化树。结果（图3）显示，同一科属的序列聚为一簇，哺乳动物的Chd2蛋白序列形成独立分支，与其他类群明显分离。值得注意的是，斑马鱼Chd2与墨西哥丽脂鲤（Astyanax mexicanus）Chd2蛋白聚于同一进化分支，二者共同与哺乳动物及其他物种区分开；然而进化树显示，斑马鱼与人的Chd2蛋白序列之间仍保持着较高的同源性。

Figure 3.  Phylogenetic tree of Chd2 proteins

为验证预测可靠性，联合使用NetSurfP-3.0和SOPMA进行二级结构预测。从数据库NCBI获取的斑马鱼Chd2蛋白序列长度分别为1 817和1 828 个氨基酸。NetSurfP-3.0结果显示，斑马鱼Chd2富含无规则卷曲（1545 个氨基酸参与），α-螺旋约13.8%，β-折叠约1.2%，无规则卷曲约85%（图4-A、B）。SOPMA预测α-螺旋36.32%，β-折叠8.48%，无规则卷曲52.06%（图4-C）。相比之下，NetSurfP-3.0结果更符合Chd2作为染色质重塑因子的内在无序特性。SWISS-MODEL三级结构显示，斑马鱼Chd2蛋白呈多结构域球形构象，由α-螺旋、β-折叠和无规卷曲构成：N端结构域（蓝色）有序排列，中央核心结构域（绿色）高度重叠且疏水核心保守，C端（红色）向左下侧回折、暴露程度较低（图4-D）。整体呈“核心保守、末端分化”的进化模式。

Figure 4.  Secondary structure and three-dimensional structures prediction of zebrafish Chd2 proteins

为探索chd2基因在胚胎发育中的时空表达动态，采用qPCR检测其在斑马鱼胚胎不同时期的表达水平。如图5-A所示，受精后4至168 h期间，chd2基因呈母源性表达，各时期均有转录，整体呈上升趋势，受精后72 h后有较高的表达。以受精后24 h为校准，峰值（受精后144 h）为32.8倍，提示其可能在神经发育中发挥调控作用。进一步检测chd2基因在成鱼14种组织（卵巢、肝脏、肾脏、肠道、肌肉、心脏、脑、眼、脊柱、鳃、精巢、鳔、鳍、皮肤）中的表达分布。图5-B结果显示，chd2基因在脑组织中表达量最高，精巢和眼睛次之，肝脏最低。以肌肉为校准，脑表达量为20.7倍，提示chd2基因可能参与神经系统发育调控。

Figure 5.  Quantitative expression analysis of the chd2 gene at different developmental stages and in various tissues.

为了研究chd2基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式，本研究采用地高辛标记的反义RNA探针进行原位杂交。探针靶向chd2基因的5'端，包含部分5'非翻译区。整体原位杂交结果显示（图6），在斑马鱼受精后4 h，chd2基因的杂交信号均匀分布于整个囊胚，表明chd2基因可能具有母源性表达特征（图6-A）。至受精后8 h（原肠胚期），chd2基因的表达信号开始集中于胚盾区域，提示chd2基因可能参与原肠运动和胚层分化（图6-B）。在受精后12 h（神经胚期），chd2基因的表达进一步区域化，与受精后8 h相比，信号强度有所增强（图6-C）。在发育早期（受精后24 h），进入体节期后，chd2基因的表达不再是泛表达，而是局限在神经板（图6-D）。至受精后48 h，chd2基因的表达主要局限于脑部，视顶盖和端脑区域信号强烈，而小脑和延脑信号较弱（图6-E）提示chd2基因可能同时参与前脑的区域特化过程。到受精后96 h，表达信号不再弥散化，区域信号增强（图6-F）。受精后120 h，可见chd2基因在视泡及前脑区域呈现信号，但弱于受精后96 h的表达（图6-G）。至受精后5 d，表达信号减弱，仅局限于眼睛和后脑（图6-H）。这种动态表达模式表明chd2基因可能在早期神经发育过程中发挥作用。

Figure 6.  Whole-mount in situ hybridization of chd2 gene in zebrafish embryos at different developmental stages.

发育性和癫痫性脑病（DEE）由发育异常与癫痫活动共同驱动^[14]，起病于新生儿至儿童期，以药物难治性癫痫、发育迟缓或倒退为特征，常伴智力、运动及行为障碍^[15]。脑电图明显异常，痫样放电加剧神经损伤^[16]。遗传因素最为普遍，已发现逾900个相关基因，多为新生突变，如今可明确约68%～80%患者的病因^[15]。但仅仅发现和克隆癫痫风险基因还远不能达到治疗癫痫的目标，需深入机制研究并构建动物模型。chd2基因定位于15q26.1，编码ATP依赖的染色质重塑蛋白，调控神经发育^[17-18]，chd2基因突变致常染色体显性DEE-94，起病中位年龄约2.5岁^[19]。半数患儿发作前即有发育迟缓，部分发作后智力倒退^[18]。癫痫类型多样，以肌阵挛最常见，光敏性癫痫约占64%～65%，多数药物难治，影像学非特异性改变^[20]，功能丧失为主要致病机制^[18]。

斑马鱼具遗传保守、胚胎透明、行为可量化、基因编辑便捷及可电生理等优势，已成神经发育障碍和癫痫的重要模型^[21]，用于神经退行性及神经疾病研究，并在雷特（Rett）综合征、自闭症谱系障碍（ASD）及癫痫中展现价值^[22]。已有chd2基因敲除品系（fdu901、fdu902）显示胚胎畸形率及死亡率升高、神经兴奋性改变^[23]，但chd2基因相关DEE斑马鱼模型仍相对匮乏。

本研究WISH显示，受精后48 h时chd2基因高表达于视顶盖和端脑。视顶盖高表达与光敏性癫痫相关，敲低模型光诱发痫样放电增加，证实其因果关系^[24-25]。机制上，chd2基因通过SNF2-like域推动核小体滑动并沉积H3.3，建立表观遗传记忆^[26]；视顶盖中高表达可能通过重塑染色质调控抑制性中间神经元，维持兴奋-抑制平衡。端脑背侧对应皮层，腹侧对应基底节，chd2基因突变相关发育迟缓、智力障碍及ASD样表现可能与端脑功能异常相关。chd2基因通过C端DNA结合域与区域特异性转录因子协同^[27]，端脑高表达反映其对chd2基因介导重塑的特异性依赖。

本研究生物信息学分析显示，斑马鱼与人类的chd2基因在蛋白结构域及关键位点高度同源，提示进化保守，斑马鱼可作为研究人类chd2基因相关疾病的理想模型。RT-qPCR检测斑马鱼10个胚胎时期chd2基因表达水平，发现chd2基因在一周龄时明显升高，提示chd2基因在神经早期分化中可能发挥阶段特异性调控作用。WISH结果进一步揭示chd2基因在胚胎中的时空表达规律为其主要富集于中前脑交界及视顶盖系统，提示其参与相关神经中枢发育调控。综上，本研究初步建立了斑马鱼chd2基因在胚胎发育中的时空表达谱，揭示了其在关键神经结构中的特异性表达规律，为后续利用斑马鱼模型深入研究chd2基因在神经发育中的分子网络及其突变致癫痫机制奠定了基础。