Cloning and functional analysis of MeCYP71E7 gene in cassava

供试木薯品种为‘华南124’，选取健康木薯茎秆剪切为长度10～15 cm的节段，每段保留2～3个完整芽点，随后定植于装有混合基质（V_营养土︰V_蛭石= 2︰1）的花盆中，将培养条件设置为温度28～30℃，光周期为12 h光照/12 h黑暗。本实验所用烟草为实验室长期保藏的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）。

在Phytozome14数据库（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）中检索获取MeCYP71E7的编码序列（coding sequence，CDS），借助Primer5.0完成引物设计，引物的合成与后续测序服务均委托深圳华大基因科技有限公司提供，所有引物相关参数详见表1。

通过Phytozome14数据库检索MeCYP71E7在不同物种内的同源序列与对应氨基酸序列，借助DNAMAN软件（DNAMAN 10）进行序列比对，得到不同物种中与MeCYP71E7同源性较高的氨基酸序列，随后通过MEGA11软件，构建系统进化树。利用PlantCARE（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件的预测，采用TBtools完成结果可视化呈现。MeCYP71E7蛋白序列的保守结构域则通过NCBI在线网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）预测。

取适量木薯叶片置于研钵内，倒入液氮充分研磨至粉末状态，采用CTAB法^[16]提取总RNA，随之将RNA反转录成cDNA（ZR108-100T，北京，庄盟），最后将cDNA贮存于−80℃冰箱备用。

从在线数据库Phytozome14中获取MeCYP71E7的CDS序列，使用Primer5工具完成pCAMBIA2300-MeCYP71E7上游引物与pCAMBIA2300-MeCYP71E7下游引物的设计（表1）。以cDNA为模板，开展MeCYP71E7目标片段的PCR扩增（Mastercycler® nexus）反应，反应程序设定为：95℃预变性3 min；95℃ 30 s、52.8℃ 30 s、72℃ 2 min，32个循环；最后72℃延伸10 min。将目标条带进行胶回收纯化，随后连接pEASY-T3克隆载体，并转入DH5α感受态细胞中^[17]，转化完成后采用菌落PCR方法开展阳性克隆验证。筛选出电泳条带单一且亮度较高的单克隆菌落，送至测序公司完成序列测定与比对分析。将测序结果与目标基因序列完全匹配的菌株置于−40℃超低温冰箱中长期保存。后续将MeCYP71E7的完整CDS序列利用T4 DNA连接酶插入pCAMBIA2300表达载体，随之将重组载体转入DH5α感受态细胞，通过菌落PCR方法初步验证阳性克隆。挑选电泳条带单一清晰的阳性单克隆菌落进行扩大摇菌培养，之后进行质粒的提取，最终通过BamH I与Sal I双酶切验证重组表达载体的构建是否正确。

为了分析MeCYP71E7在木薯不同组织中的表达量，本研究利用在线数据TCOD expression（https://shiny.datasci.danforthcenter.org/cassava_atlas/）查找该基因在木薯不同组织中的表达水平，并用Prism8软件绘图。

使用Primer5软件进行MeCYP71E7定量引物的设计（表1），本研究选取延伸因子基因（Elongation factor，EF）作为内参基因，以合成的cDNA为模板，利用荧光定量PCR仪（CFX Connect^TMReal-Time）开展MeCYP71E7过表达和沉默载体检测。具体反应体系配置如下：ddH₂O 6.5 μL、cDNA模板 0.2 μL、上游引物 0.4 μL、下游引物 0.4 μL，以及SYBR荧光染料7.5 μL。反应设置：95℃ 3 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 20 s，45个循环。所有样品均设置3个生物学重复，通过2^−ΔΔCt进行数据分析，并通过单因素方差分析法完成统计分析。

采用双酶切将MeCYP71E7的CDS片段插入到pCAMBIA2300载体中，成功构建35S::MeCYP71E7-GFP重组载体，随后转化至GV3101农杆菌。使用含有10 mmol·L⁻¹ MgCl₂、50 mmol·L⁻¹ MES和150 μmol·L⁻¹ AS的渗透液制备OD₆₀₀值为0.6的农杆菌菌液，并将其置于冰上静置处理^[18]。最后将农杆菌菌液注射到烟草叶片的下表皮，48 h左右取叶片，在共聚焦显微镜（LSM900，ZEISS）下，观察荧光情况。

为明确MeCYP71E7的抗病功能，本试验首先构建该基因的过表达与沉默木薯材料系，后续对处理后的木薯叶片开展Xam（实验室保存）接种试验。试验过程中，将重组过表达载体pCAMBIA2300-MeCYP71E7、空载pCAMBIA2300，以及pTRV1、pTRV2与沉默重组载体pTRV2-MeCYP71E7分别转入GV3101农杆菌感受态。过表达组以转入空载pCAMBIA2300的农杆菌侵染材料为空白对照（Mock-1/Mock-2），转入pCAMBIA2300-MeCYP71E7的农杆菌侵染材料为处理组（MeCYP71E7-OE-1/MeCYP71E7-OE-2），采用无菌注射器将菌液注入木薯叶片下表皮。侵染3 d后，分别采集各单株上被农杆菌侵染的叶片提取总RNA，分析目的基因的相对转录水平以验证过表达率。验证植株已过表达后，对已完成农杆菌侵染的叶片接种Xam病原菌，Xam病原菌OD₆₀₀值到达0.8左右，第6天进行病斑面积及表型统计。

沉默设置浓度一致的pTRV1和pTRV2农杆菌等比例混合作为对照组（CK-1/CK-2），pTRV2-MeCYP71E7和pTRV1混合菌液作为试验组（MeCYP71E7-RNAi-1/MeCYP71E7-RNAi-2），用无菌注射器注射到木薯叶背面，侵染12 d后取上层未注射农杆菌的叶片提取RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板来进行RT-qPCR验证，分析沉默相对转录水平，随后，对上层未注射农杆菌的新叶片接种Xam，进行病斑面积统计。

取−80℃保存的AH109菌株，划线于YPDA固体平板上，置于28℃培养2～3 d；挑取平板上生长的酵母单菌落，置于5 mL的YPDA液体中，28℃摇床培养8～10 h；吸取一定量的AH109菌液（由实验室保存），置于50 mL的YPDA溶液中进行转摇，调节初始OD₆₀₀值为0.2～0.3，之后置于28℃培养3～5 h，使OD₆₀₀值到达0.6左右；将菌液分装在50 mL离心管中，4 000 r·min⁻¹，低转速离心10 min，去上清；每管加人40 mL的ddH₂O重悬，4 000 r·min⁻¹，低转速离心10 min，去上清；加人2 mL的1×TE/LiAC重悬，完成酵母感受态细胞的制备。

ssDNA分别与pGBKT7、pGADT7、pGADT7-MeCYP71E7质粒组合各10 μL混合，将混合液置于2 mL离心管中；接着加入酵母感受态细胞0.2 mL，PEG/LiAC 0.6 mL，随后颠倒混匀。将离心管置于28℃摇床中培养1 h，随后加入70 μL DMSO，于42℃水浴环境中热激30 min；以12000 r/min的转速离心30 s后去除上清液；用300 μL 1×TE缓冲液重悬沉淀，将其涂布在SD-Trp/-Leu和SD-Trp/-Leu/-Ade/-His培养基上，28℃进行培养。

将pGBKT7与pGBKT7-MeCYP71E7两种重组载体分别涂布在SD-Trp和SD-Trp/-Ade/-His固体培养基，观察其生长情况来判断pGBKT7-MeCYP71E7是否有自激活现象。实验采用4种浓度梯度稀释接种至对应培养基上。

使用WPS Office和SPSS 24进行数据处理和方差分析，采用单因素方差分析，当P<0.05时，代表处理间差异显著（P<0.05）。使用GraphPad Prism 8.0.1作图。

克隆MeCYP71E7基因，提取木薯叶片总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，结果显示存在28S、18S和5S 3条清晰条带，说明所提取的RNA完整性较好，无明显降解（图1-A），可用于后续实验。随后将RNA反转录成cDNA，利用MeEF1a对cDNA进行PCR质量验证，扩增产物呈现单一清晰条带，说明cDNA反转录成功（图1-B）。以上述cDNA为模板进行PCR扩增，凝胶电泳在1 000 ～2 000 bp处存在特异性条带，MeCYP71E7的CDS全长为1 536 bp，扩增条带与目的基因大小一致（图1-C）。随后，对PCR产物进行胶回收，并连接到pCAMBIA2300载体，转入DH5ɑ，涂布到培养基上，接着进行菌落PCR，阳性单克隆摇菌，提取质粒，最后利用BamH I/Sal I进行酶切验证，目的条带在1 000～2 000 bp之间，即为目的条带（图1-D），并进行测序验证，证实MeCYP71E7已构建到pCAMBIA2300载体上，即MeCYP71E7过表达载体构建成功。

Figure 1.  Amplification of the MeCYP71E7 fragment and construction the expression vector

为明确MeCYP71E7基因与其他植物的进化关系。通过MEGA11软件，对木薯、玉米、棉花、番茄、柑橘、拟南芥6种植物的CYP基因和MeCYP71E7绘制进化树（图2-A）。研究发现，MeCYP71E7和棉花CYP的同源性较高。此外，对MeCYP71E7上游的序列进行顺式作用元件分析发现，MeCYP71E7启动子区域含有核心元件TATA-box，增强元件CAAT-box，激素响应元件ABRE、CGTCA等，光响应元件G-Box，还含有转录因子MYB和MYC等结合位点（图2-B）。蛋白质结构域分析发现，MeCYP71E7属于CYP450家族，属于CYP71亚家族（图2-C）。

Figure 2.  Bioinformatics analysis of MeCYP71E7

分析MeCYP71E7在木薯不同组织中的表达量，本研究利用在线数据TCOD expression查找该基因在木薯不同组织中的表达水平，并用Prism8软件绘制。MeCYP71E7在木薯的根、叶柄、叶脉、侧芽、块根、根尖分生组织、茎中均有表达（图3-A）。MeCYP71E7在木薯根中的表达量显著高于其他组织中的表达，其次为叶柄、叶脉、侧芽、块根、根尖分生组织、茎以及叶，表达量均不显著。另外，MeCYP71E7在木薯叶中的表达量虽被检测到，但表达水平最低。为进一步证实MeCYP71E7表达量是否受到细菌性枯萎病影响，通过RT-qPCR测定不同时间点的相对表达量（图3-B）。结果显示，MeCYP71E7表达量随时间延长其逐渐升高（0、1、2 、4 h）。

Figure 3.  Expression profiling of MeCYP71E7 in different tissues of cassava

明确MeCYP71E7在木薯中的表达位置，构建35S::MeCYP71E7-GFP融合表达载体并进行瞬时表达。侵染烟草叶片背面，瞬时表达48 h后，通过共聚焦显微镜观察叶片发现，在35S启动子的驱动下，绿色荧光蛋白可以与MeCYP71E7融合表达，其表皮细胞的细胞核、质膜上存在绿色荧光。为进一步验证定位的准确性，将观察到绿色荧光的叶片用细胞核染色试剂DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色2.5 h，共聚焦荧光显微镜下看到DAPI所发出的蓝色荧光所显示的细胞核位置与MeCYP71E7-GFP的绿色荧光相一致，叠加后位置重合（图4）。结果表明，MeCYP71E7定位于细胞核、细胞膜。

Figure 4.  Subcellular localization of MeCYP71E7

探究MeCYP71E7对Xam侵染后抗病的影响，本研究构建MeCYP71E7过表达株系，并对木薯叶片接种Xam。过表达MeCYP71E7植株中的MeCYP71E7的表达量显著高于对照组（5-A），说明木薯MeCYP71E7过表达植株构建成功。同时对病斑面积进行了统计，实验显示，与对照相比，MeCYP71E7病斑面积显著降低（图5-B），MeCYP71E7发病情况明显轻于对照组（图5-C），推测MeCYP71E7基因参与调控木薯的抗病性。

Figure 5.  The effect of MeCYP71E7 overexpression on cassava disease resistance

进一步确定MeCYP71E7抗病性，本研究建立了MeCYP71E7沉默植株体系。结果显示，MeCYP71E7-RNAi-1和MeCYP71E7-RNAi-2木薯植株中的表达量降低，表明MeCYP71E7沉默株系构建成功（图6-A）。进一步分析叶片的病斑面积，实验显示，MeCYP71E7沉默病斑面积扩大（图6-B），发病情况明显重于对照组（图6-C）。可见，MeCYP71E7正调控木薯抗病性。

Figure 6.  The effect of MeCYP71E7 silenced on cassava disease resistance

进一步解析MeCYP71E7调控木薯抗病的分子机制，我们构建MeCYP71E7的pGADT7载体。以木薯cDNA为模板，用引物pGADT7-MeCYP71E7进行PCR扩增，凝胶电泳检测到片段大小约1 536 bp与目的基因实际长度一致（图7-A）。利用同源重组技术将目的片段连接到EcoR I/BamH I双酶切pGADT7载体上。连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受细胞中，挑选单菌落作为模板并PCR验证。结果显示，扩增片段同目的基因克隆长度相同（图7-B）。挑选5个阳性克隆，对其质粒酶切验证（图7-C）并测序检验。保留测序结果与目的基因一致的克隆用于后续酵母双杂实验。

Figure 7.  Construction of pGADT7-MeCYP71E7 gene vector

验证MeCYP71E7是否存在自激活。本研究将重组质粒pGBKT7-MeCYP71E7和空载质粒pGBKT7分别转入AH109，同时以空载pGBKT7作为对照。随后将稀释为4个梯度的酵母菌液分别点涂于SD-Trp（一缺）和SD-Trp/-Ade/-His（三缺）固体培养基上，并观察酵母生长状况。实验结果表明，在在一缺培养基上，两组酵母能够正常生长，且酵母数量随菌液稀释倍数的增加而逐渐减少。而在三缺培养基上，两组处理均未出现酵母生长（图8）。可见，MeCYP71E7不存在自激活活性。

Figure 8.  The self-activation validation of pGBKT7-MeCYP71E7

进一步探究MeCYP71E7调控木薯抗病反应的分子机制，本研究实验室前期使用酵母双杂交进行筛库，初步筛选到MeMYB4，通过点对点验证MeCYP71E7与MeMYB4互作。酵母双杂交实验结果表明，pGADT7-MeCYP71E7和pGBKT7-MeMYB4共转化AH109，在二缺（SD-Trp/-Leu）和四缺（SD-Trp/-Leu/-His/-Ade）的培养基上均可正常生长，并且随着菌液浓度（10⁻¹、10⁻²、10⁻³、10⁻⁴）稀释，生长的菌落呈现梯度减少趋势，而其他3组酵母菌在二缺培养基能正常生长，四缺培养基无法生长（图9）。结果表明MeCYP71E7与MeMYB4之间是互作的。

Figure 9.  The Validation of the interaction between MeCYP71E7 and MeMYB4

细胞色素 P450（CYP450）是一类以血红素为辅基的末端加氧酶，因在 450 nm 波长下存在特征吸收峰而得名 ^[19]。CYP71 家族隶属于 CYP450 超家族的 CYP71 簇，该家族成员数量最为丰富，在植物次生代谢合成通路中发挥关键功能 ^[20−21]。整体而言，CYP450 超家族是植物代谢网络的核心功能蛋白 ^[22]。在木薯中，CYP71E7 属于肟代谢关键酶，直接参与氰苷生物合成；本研究围绕木薯 MeCYP71E7 基因，系统解析其调控木薯细菌性枯萎病抗性的分子功能。

本研究成功从木薯中克隆得到 CYP450 超家族基因 MeCYP71E7，蛋白结构域分析结果证实该基因归属于 CYP450 超家族 CYP71 亚家族。CYP450 基因家族在各类植物中均高度保守，保守结构域可将血红素稳定锚定在蛋白活性中心，维持蛋白核心构象完整 ^[23]。对 MeCYP71E7 启动子序列开展顺式作用元件预测分析，结果显示，该启动子包含 TATA-box 核心启动子元件、CAAT-box 增强子元件以及多种植物激素响应顺式元件，预示 MeCYP71E7 的转录表达受多条激素信号通路协同调控。烟草 CYP82E4 启动子同样富集 TATA-box、CAAT-box 及各类激素响应元件，与本研究结果一致 ^[24]。组织表达模式检测表明，MeCYP71E7 在木薯不同组织器官中表达水平差异显著，其中根部表达量最高，叶柄次之。已有研究报道，大豆（Glycine max（L.）Merr.）GmCYP82D26、黄瓜（Cucumis sativus L.）CsCYP82D47 与 CsCYP82D102 均在根系优势表达，与本研究组织表达特征相符 ^[23,25]。亚细胞定位结果显示， MeCYP71E7 定位于细胞核与细胞膜；与之不同的是，大豆 GmCYP82D26 瞬时表达于烟草表皮细胞时定位于内质网 ^[25]，推测该类 CYP71 家族蛋白的亚细胞分布存在物种特异性，功能分化或与此相关。

CYP450 蛋白可介导多条次生代谢通路合成防御类活性物质，通过积累毒性代谢产物提升植物对昆虫、病原菌等生物胁迫的耐受能力 ^[26]。本研究抗病表型鉴定结果显示，过表达 MeCYP71E7 能够显著缩小木薯叶片细菌性枯萎病病斑面积，沉默 MeCYP71E7 则会加剧病斑扩展，证明 MeCYP71E7 对木薯细菌性枯萎病抗性具有正向调控作用。现有诸多研究也证实 CYP71 亚家族成员为植物抗病正调控因子：水稻 CYP716A16 过表达可增强植株对立枯丝核菌、稻黄单胞菌的抗性 ^[27]；拟南芥 CYP82C2、CYP71A12/13 催化含氰吲哚防御物质 4-OH-ICN 合成，相关基因突变体对丁香假单胞菌敏感性大幅上升，明确了 CYP450 介导氰基代谢产物在植物免疫中的核心地位 ^[28]；水稻 CYP71Z2 稳定过表达可长期增强植株抗细菌性枯萎病能力 ^[11]。

为进一步阐明 MeCYP71E7 介导抗病性的分子机制，本研究筛选其互作靶蛋白。自激活检测证明 MeCYP71E7 诱饵载体无自主转录激活活性，与水稻 OsCYP22 诱饵载体特性一致 ^[29]；酵母双杂交试验进一步验证 MeCYP71E7 可与转录因子 MeMYB4 发生蛋白互作。已有研究表明，遭受生物胁迫时，植物可激活 CYP450 依赖的次生代谢通路，合成具备抑菌、抗虫活性的代谢物以抵御病虫害 ^[30]；梨（Pyrus spp）CYP714C2 与 GA2ox1 互作共同调控果实抗病能力 ^[31]；拟南芥 AtCYP71 结合组蛋白 H3，参与调控植物器官建成进程 ^[32]；梨 PpyMYB144 可转录激活细胞色素 P450 基因 PpyCYP86B1，调控果皮褐变过程 ^[33]；番茄（Solanum lycopersicum L.）CYP94C1 敲除后内源防御激素积累，植株病原菌抗性显著提升 ^[34]；棉花（ Gossypium hirsutum L.）CYP450 通路通过重塑黄酮代谢通量抑制枯萎病发病进程 ^[35]。结合本实验结果推测，MeCYP71E7 与 MeMYB4 形成蛋白复合物，协同激活下游抗病应答通路，进而正向调控木薯细菌性枯萎病抗性。

综上，本研究明确 MeCYP71E7 是木薯免疫应答的正向调控基因。但 MeMYB4 与 MeCYP71E7 协同介导抗病的完整分子通路仍较为复杂，相关调控环节有待进一步验证。后续可深入解析 MeCYP71E7 调控木薯抗细菌性枯萎病的完整分子网络，为木薯抗病分子育种、稳产增产提供理论支撑。

MeCYP71E7为CYP450家族，属于CYP71亚家族，并且其启动子存在多种顺式作用元件。MeCYP71E7定位于细胞核等，且在不同部位表达量不同。进一步通过过表达和基因沉默证实，MeCYP71E7正调控对木薯细菌性枯萎病抗性。