Application of the DRIS diagnostic method in the study of Yellowing Areca catechu

研究区域位于海南省部分市县，该地区属热带季风海洋气候区。气候特点为四季不分明，气温常年较高且稳定；干湿季分明，夏季多雨，热带气旋活动频繁；光照、热量与水资源均较为丰富，但易受台风、干旱、寒害等灾害影响。该区域年平均气温介于22.5～25.6℃之间，年日照时长1 780～2 600 h，太阳总辐射量4 500～5 800 MJ·m⁻²，年降水量1 500～2 500 mm（数据来源于海南省气象局）。本次采样以果园植株是否全部正常（无黄化现象）或全部黄化为区分标准，分别在海南省定安县、屯昌县、琼中黎族苗族自治县、乐东黎族自治县、三亚市、陵水黎族自治县、万宁市、琼海市、文昌市共9个市县的槟榔果园开展。其中，正常果园12个，黄化果园22个。

统一选择树龄10～15年、土壤类型为砖红壤的槟榔果园作为试验场地，分为2类试验园：以无黄化叶片、平均单株年产量10～15 kg的果园为正常园；以有5片以上黄化叶片、平均单株年产量低于3kg的果园为黄化园。各果园均采用梅花5点取样法选定15株代表性槟榔树，每5株叶片混合制备1份混合样品，每个果园共获得3份混合样品，每份样品鲜质量约500g。已有研究表明，槟榔植株自上而下第3片复叶生理指标最接近植株平均水平，黄化病症表征也最为显著^[14]，因此，本试验统一采集目标植株从上数第3片复叶中部小叶，借助伸缩合金采摘杆完成野外采样。样品运回实验室后，先用去离子水快速冲洗、擦干表面水分，采用电子天平测定鲜质量；随后放入烘箱，105℃杀青30 min，调至65℃恒温烘干至恒重；干燥样品粉碎后过1 mm孔径筛，分装密封，置于干燥器内保存待测。

N采用H₂SO₄−H₂O₂消煮−纳氏试剂比色法测定；磷（P）采用H₂SO₄−H₂O₂消煮−钼锑抗比色法测定；K、Na采用干灰化−稀盐酸溶解−火焰光度计法测定；硫（S）用HNO₃−HClO₄−HCl消煮−硫酸钡比浊法测定；B采用干灰化−姜黄素比色法测定；Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn采用干灰化−稀盐酸溶解−原子吸收分光光度法测定。

使用WPS（2023）、IBM SPSS Statistics（26.0）和Origin Pro（2022）对数据进行分析和可视化。采用单因素方差分析和Duncan多重范围检验评估正常和黄化叶片养分含量之间的差异。所有数据均以平均值±标准差表示，P<0.05表示具有显著差异。

通过对34个槟榔园的统计分析，基于DRIS参数筛选方法，将槟榔园叶片的营养元素分析值及比值以N、P、K、Na、Ca、Mg、S、Fe、Mn、Cu、Zn、B、N/P、N/K、N/Na、N/Ca、N/Mg、N/S、N/Fe、N/Mn、N/Cu、N/Zn、N/B、P/K、P/Na、P/Ca、P/Mg、P/S、P/Fe、P/Mn、P/Cu、P/Zn、P/B、K/Na、K/Ca、K/Mg、K/S、K/Fe、K/Mn、K/Cu、K/Zn、K/B、Na/Ca、Na/Mg、Na/S、Na/Fe、Na/Mn、Na/Cu、Na/Zn、Na/B、Ca/Mg、Ca/S、Ca/Fe、Ca/Mn、Ca/Cu、Ca/Zn、Ca/B、Mg/S、Mg/Fe、Mg/Mn、Mg/Cu、Mg/Zn、Mg/B、S/Fe、S/Mn、S/Cu、S/Zn、S/B、Fe/Mn、Fe/Cu、Fe/Zn、Fe/B、Mn/Cu、Mn/Zn、Mn/B、Cu/Zn、Cu/B、Zn/B共78种形式呈现，分别计算出槟榔叶片正常组与黄化组各形式的平均值、标准差、变异系数、方差及2组间的方差比，并对2组的分析值进行独立样本t检验。

DRIS指数能够表示出槟榔对养分的需求强度及需求顺序 ^[15-17]；诊断指数为负值，表示该种植株需要该种元素，负值绝对值越大表示树体对这种元素的需求程度越大；当表现为正值，表示该种元素在植株体内是充足或过量的，值越大代表这种元素越过剩。

若诊断元素有A、B、C…共n个，则DRIS指数计算公式如下：

式中，A/B代表叶片中A、B元素含量比值的实测值，a/b代表叶片中A、B元素含量比值的参比值（以正常叶片A/B比值的均值），CV为a/b的变异系数，n为诊断元素的个数。

采用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）评估正常与黄化叶片中养分含量的整体差异；进一步采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）验证2组间的差异，并通过变量主成分贡献度筛选贡献度最高的元素。

由表1的数据分析可知，正常植株叶片各元素含量的排序为：N > Na > K > Ca > S > Mg > P > Mn > Fe > B > Zn > Cu。黄化植株叶片养分含量的排序为：N > S > K > Na > Mg > Ca > P > Mn > Fe > B > Zn > Cu。N是正常和黄化叶片中含量最高的元素，在正常叶片中仅次于 N 的为Na元素，而黄化叶片为 S 元素，二者的养分含量存在差异。正常叶片中元素含量呈现Na > Ca > S的关系，而黄化叶片中则为S > Na > Ca。

统计分析结果显示，黄化叶中Na、Ca的含量显著低于正常叶（P<0.05），S、Mn的含量则显著高于正常叶（P<0.05）。

以正常槟榔叶片作为营养诊断标准值，采集12个正常果园的槟榔叶片作为诊断样品，以其平均值确定营养诊断指标范围（表2）。营养诊断指标为N：14.69～20.46 g·kg⁻¹，P：0.90～1.60 g·kg⁻¹，K：4.58～7.82 g·kg⁻¹，Na：5.71～8.55 g·kg⁻¹，Ca：5.39～6.80 g·kg⁻¹，Mg：1.58～2.37 g·kg⁻¹，S：2.46～4.59 g·kg⁻¹，Fe：41.69～119.98 mg·kg⁻¹，Mn：83.05～115.54 mg·kg⁻¹，Cu：3.90～5.73 mg·kg⁻¹，Zn：9.41～15.10 mg·kg⁻¹，B：9.88～15.38 mg·kg⁻¹。

根据表3的数据对比，可得正常组与黄化组槟榔叶片在多种矿质元素含量上存在显著差异。具体而言，Na、Ca、S三种元素在两组间的差异达到了极显著（P<0.01），而Cu元素的差异则表现为显著（P<0.05）。进一步通过方差分析，得出正常组与黄化组之间的方差比，其中大于1（表明正常组方差大于黄化组）的比例仅占20.51%，而小于1的比例则高达79.49%。结果表明，正常组槟榔叶片在元素含量稳定性要优于黄化组。

结果表明，正常组槟榔叶片的N、P、K、Na、Ca、Mg、S、Fe、Mn、Cu、Zn、B等营养元素的平均含量分别为17.58、1.25、6.20、7.13、6.10、1.97、3.53 g·kg⁻¹、80.83、99.29、4.83、12.25、12.63 mg·kg⁻¹。而黄化组槟榔叶片的相应元素平均含量有所不同，分别为15.72、1.09、4.78、3.36、2.13、2.74、6.75 g·kg⁻¹、72.53、154.91、7.89、11.74和14.50 mg·kg⁻¹。

从变异系数的角度分析，正常组槟榔叶片各营养元素的变异系数范围较为集中，处于11.58%～48.43%之间；而黄化组的变异系数范围则相对较大，为19.42%～85.68%。结果再次说明，正常组槟榔叶片的元素含量的波动较小，稳定性更好。

由表3可知，在78种元素表现形式种中，Na、Ca、S、Cu、N/Ca、N/S、N/Mn、P/Ca、P/S、P/Mn、K/Ca、K/S、K/Mn、Na/S、Na/Fe、Na/Mn、Na/Cu、Ca/S、Ca/Fe、Ca/Mn、Ca/Cu、Ca/Zn、Ca/B、S/Fe、S/Cu、S/B、Mn/Zn共27种元素表现形式呈显著性差异，排除Na、Ca、S、Cu 4个本身存在显著性差异的元素，在正常叶片与黄化叶片中，体现显著性差异的表现形式为N/Mn、P/Mn、K/Mn、Mn/Zn。黄化叶片的Na含量显著低于正常叶片，Ca含量也显著低于正常叶片；S含量和Cu含量则分别显著高于正常叶片。黄化叶片的N/Mn、P/Mn以及K/Mn水平均显著低于正常叶片，Mn/Zn水平显著高于正常叶片。

DRIS诊断结果表明（表4），黄化槟榔叶片的12种营养元素中，9种元素呈过量状态，3种元素呈亏缺状态。其中，S的指数最高（49.09），其次为Mn（47.88），表明黄化植株体内S和Mn已显著过剩；而Na（-126.32）、Ca（-102.85）和K（-8.82）呈负值，显示这三者处于缺乏水平，且Na与Ca的亏缺程度极为严重，K仅为轻度缺乏。需肥紧迫性排序为Na > Ca > K。该结果与叶片养分含量统计2.1吻合，黄化叶中Na、Ca含量极显著低于正常叶（P<0.05）。

通过对槟榔产区的正常槟榔园叶片营养元素进行相关性分析（图1），发现槟榔叶片矿质元素间存在复杂的正负关联（P<0.05）。其中，大量元素N与P、P与K之间呈显著正相关；中量和微量元素中，Na与Ca呈显著正相关，Na与S呈显著负相关；Ca与Mg、S、Mn均呈显著负相关；Mg与Mn、B呈显著正相关；S与Mn呈显著正相关。

Figure 1.  Correlation analysis of nutrient elements in Areca catechu leaves

通过对黄化叶片和正常叶片进行PCA分析（图2）。前两个主成分（PC1和PC2）累计解释了34.24%的数据总变异，其中PC1贡献了24.26%，是区分样本的最主要方向。从PCA图可知，黄化叶片组与正常叶片组的样本点呈现出沿PC1轴的明显分离趋势，表明黄化叶片与正常叶片在矿质元素组成上存在明显差异。

Figure 2.  PCA analysis of Areca catechu leaves

PLS-DA分析结果进一步显示（图3），黄化与正常叶片样本的分离更为清晰和集中。这证实了本研究所发现的元素失衡模式并非偶然，而是与槟榔叶片生理性黄化现象存在因果关系。变量主成分贡献度结果显示，Ca和Na显示出最高的负向载荷（分别为-0.61和-0.46），而S则表现出较高的正向载荷（0.41）。说明Ca和Na含量的显著降低，以及S含量的显著升高，是导致黄化叶片样本在最主要变异方向上偏离正常叶片的主要原因。这一结果与本文2.1节中黄化叶中Na、Ca含量显著低于正常叶（P<0.05），S含量显著高于正常叶（P<0.05）的统计结论，以及2.3节中DRIS指数显示Na、Ca严重缺乏（指数分别为-126.32和-102.85）而S严重过量（指数49.09）的结果一致。

Figure 3.  PLS-DA analysis of Areca catechu leaves

本研究测定了健康与黄化槟榔叶片矿质营养，结果显示，海南健康槟榔功能叶养分含量顺序为 N > Na > K > Ca > S > Mg > P > Mn > Fe > B > Zn > Cu。该排序与陈才志 ^[18] 报道的槟榔老叶年均养分规律基本吻合，但本研究叶片 Na 含量偏高、甚至高于 K，与王汀忠等 ^[19]报道的 Mg > Cl > Na > Zn > B > Cu 的元素排序存在明显出入，说明槟榔叶片矿质元素组成存在明显种内差异，推测主要受采样部位与树龄调控。

从采样部位来看，本研究统一选取自上而下第 3 片功能复叶，已有研究多以老叶为试验材料，而功能叶对 Na 的富集能力显著高于老叶 ^[14]，直接提升了本试验叶片 Na 相对含量，改变元素排序；从树龄角度分析，本试验供试植株均为 10～15 年生成龄槟榔，树龄区间统一，而既往研究样本树龄跨度更大，幼树与成龄植株矿质元素吸收、转运及分配特性不同，也会造成叶片养分相对比例出现分化。综上，采样叶位、树龄是造成不同研究中槟榔叶片矿质元素排序不一致的关键因素，后续开展槟榔营养诊断时，需统一采样标准以消除试验误差。

与正常叶片相比，黄化叶片的养分排序差异明显，其养分含量为N > S > K > Na > Mg > Ca > P > Mn > Fe > B > Zn > Cu。结果表明，黄化叶中Na、Ca含量显著低于正常叶，S、Mn含量显著高于正常叶。本研究中，黄化槟榔叶Ca含量较正常叶显著降低（P<0.05），与前人报道的低产园低钙特征一致 ^[13]。现有研究证实，Ca是细胞壁果胶Ca、细胞膜稳定的关键组分 ^[20-21]，低钙可能干扰叶绿体稳态及Ca²⁺依赖的生理调控，与黄化表型存在关联。

Na属于有益元素，其主要作用是参与植株体内的渗透调节过程，维持细胞膨压，增强植株的抗旱、抗盐能力，同时辅助促进其他阳离子的吸收与转运 ^[20]。黄化槟榔叶片中Na含量显著偏低，会导致植株渗透调节能力下降，细胞保水能力减弱，叶片易出现萎蔫、早衰现象，且抗逆性降低，在高温、干旱等环境条件下，会进一步加重叶片黄化程度，与Ca缺乏形成协同效应，加速植株生长势衰退 ^[22]。

S是植物体内蛋白质、氨基酸、叶绿素及多种酶类的重要组成成分，适量的S可促进槟榔叶片光合作用和生理代谢，但过量积累会对植株产生毒害作用 ^[23]。本研究中黄化槟榔叶片S含量显著偏高，一方面会破坏植株体内的离子平衡，抑制根系对Ca²⁺等必需阳离子的吸收 ^[24]，导致间接缺素，进一步加剧叶片黄化；另一方面，过量的S会在叶片内积累形成硫化物，破坏叶绿素结构，导致叶片出现暗绿、僵硬、老叶提前老化脱落等异常现象，与Ca、Na缺乏共同导致叶片生理功能紊乱 ^[25]。

Mn作为植物生长发育所需的微量元素，参与叶绿素合成、光合作用电子传递及多种酶促反应，但其含量过高会对槟榔产生明显的毒害作用。本研究中，黄化槟榔叶片Mn含量显著升高，这与热带酸性土壤Mn易活化积累的土壤特性密切相关。过量的Mn会诱导植株体内Ca等必需元素的拮抗吸收 ^[26]，导致缺钙等间接缺素症状，破坏叶绿素合成与代谢平衡，使叶片出现斑点状黄化、脉间失绿等现象；同时，过量Mn会损伤槟榔根系细胞，抑制根系生长和养分吸收功能，形成“根系受损、养分吸收不足、叶片黄化、根系进一步受损”的恶性循环，加重槟榔黄化程度 ^[26]。

综合来看，黄化槟榔叶片Na、Ca含量显著降低，S、Mn含量显著升高，形成了典型的缺乏与过量的协同失衡模式，这种矿质元素失衡是导致槟榔生理性黄化的重要营养原因。

黄化组对应元素含量除Mg、S、Mn、Cu、B外均低于正常组，其中Ca和Na的降幅最为显著，而S和Mn则显著高于正常植株的含量。从变异系数来看，正常组元素变异区间为11.57%～48.42%，远低于黄化组的19.42%～85.67%，这表明黄化槟榔树体的矿质营养元素含量平衡稳定性差。

本研究结果表明，Ca与S、Mn呈显著负相关，是由于海南热带砖红壤pH多低于5.5的酸性特征 ^[27]，在酸性条件下，闭蓄态Mn²⁺易于活化 ^[25]。同时，过量S可与Ca结合形成难溶性CaSO₄沉淀，过高的Mn亦会竞争性抑制钙转运蛋白的活性，二者共同限制了Ca向地上部的运输 ^[24,28]。

这种拮抗效应还会放大缺Ca的危害，Ca作为细胞壁果胶钙的核心组分，其缺乏不仅会直接导致细胞壁结构解体、细胞膜透性增加，还会削弱植株对Mn毒害的耐受能力，形成“土壤Mn活化−植株Mn累积−Ca吸收受阻−细胞膜损伤−Mn进一步入侵”的恶性循环^[26]，最终诱发或加重叶片黄化。

在生产实践中，除减施含S肥料外，可通过施用石灰将土壤pH提升至5.5～6.0区间，既可降低Mn的生物有效性，又能补充Ca源 ^[29]，缓解高Mn抑Ca的情况。

综合PCA与PLS-DA的分析结果，发现Ca、Na、S是导致槟榔叶片黄化的关键元素，Ca、Na剧降和S骤升是叶片从正常生理状态转向黄化失绿状态最显著的化学特征，这为营养诊断提供了明确的重点监测指标。

其次，元素间存在缺乏及过量的协同失衡模式。分析表明，黄化并非由单一元素的含量异常引起，而是表现为Ca、Na缺乏与S、Mn过量并存的多重障碍。这种协同失衡可能引发连锁生理危害，Ca在维持细胞壁以及细胞膜的完整性中发挥重要作用 ^[30]，其缺乏会削弱细胞壁和膜结构 ^[21]；Na缺乏降低渗透调节与抗逆性；而过量的S和Mn可能产生直接毒害或通过拮抗作用抑制其他元素如Fe、Ca的吸收 ^[28]。

基于此，在施肥过程中，发生黄化现象的植株优先补充Na肥与Ca肥，同时注意减少S肥的施用以及抑制酸性土壤中Mn的活化。

本研究仍然存在一定的局限性，未来将继续开展不同树龄与品种黄化现象的深入研究，并结合土壤有效养分、根系活力及病原菌检测开展综合研究。后续也会通过田间控制试验与多维度监测对DRIS标准进一步优化。

槟榔黄化叶片矿质营养含量及排序显著区别于正常叶片。正常槟榔功能叶养分含量排序为N > Na > K > Ca > S > Mg > P > Mn > Fe > B > Zn >Cu，黄化叶则变为N > S > K > Na > Mg > Ca > P > Mn > Fe > B > Zn > Cu；黄化叶中Na、Ca含量较正常叶显著降低（P<0.05），S、Mn含量显著升高（P<0.05），且黄化叶各元素变异系数（19.42%～85.68%）远高于正常叶（11.56%～48.43%），Ca、Na缺乏与S、Mn过量协同是诱发槟榔生理性黄化的核心营养因素。

基于正常叶片建立了槟榔营养诊断标准，为黄化防控提供量化依据。12种营养元素的诊断指标范围如下：N（14.69～20.46 g·kg⁻¹）、P（0.90～1.60 g·kg⁻¹）、K（4.58～7.82 g·kg⁻¹）、Na（5.71～8.55 g·kg⁻¹）、Ca（5.39～6.80 g·kg⁻¹）、Mg（1.58～2.37 g·kg⁻¹）、S（2.46～4.59 g·kg⁻¹）、Fe（41.69～119.98 mg·kg⁻¹）、Mn（83.05～115.54 mg·kg⁻¹）、Cu（3.90～5.73 mg·kg⁻¹）、Zn（9.41～15.10 mg·kg⁻¹）、B（9.88～15.38 mg·kg⁻¹）。

DRIS 营养诊断法与多元统计分析结论相互印证。DRIS 指数结果表明，黄化叶片存在 Na、Ca 重度亏缺，S、Mn 过量累积的营养失衡问题，叶片矫正施肥优先级依次为 Na > Ca > K；主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进一步证明，Ca、Na 含量下降与 S 含量上升是区分健康叶片与黄化叶片样本的核心差异指标。