Sequence variation and salt-tolerant haplotype mining of HAK family genes during rice domestication

本研究以籼稻‘9311’为受体与云南元江普通野生稻为供体亲本构建的178份BC₃F₈渗入系群体为基础材料，并以‘9311’作为对照。试验材料均在人工气候室进行水培种植，环境参数设定为：14 h光照（28℃）/10 h黑暗（25℃），光照强度约500 µmol·（m²·s）⁻¹，空气相对湿度维持在70%。正常培养阶段采用基于经典Yoshida配方的水稻标准干粉培养基配制的营养液。营养液每3 d彻底更换1次，并调节pH至5.5～5.8，以维持根系最佳的离子吸收微环境。

为探究HAK家族基因在水稻驯化中的受选择情况，本研究从水稻超级泛基因组信息资源数据库（http://www.ricesuperpir.com/）中检索并下载了27个HAK家族基因的基因组序列。该数据库共涵盖了251份具备高度遗传代表性的栽培稻与野生稻参考基因组 ^[25]。利用MEGA 6.0软件对基因组序列和氨基酸序列进行多重比对，并采用DnaSP v5软件分别计算野生稻、籼稻和粳稻群体中各基因的核苷酸多样性（π）和中性检验统计量（Tajima’s D值），据此筛选出在驯化中受强烈选择的候选靶标基因。序列分析所用材料主要是OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13基因。用于分析OsHAK7基因序列的材料共211份，包括野生稻材料21份，籼稻材料132份，粳稻材料58份；用于分析OsHAK9基因序列的材料共211份，包括野生稻材料24份，籼稻材料129份，粳稻材料58份；用于分析OsHAK13基因序列的材料共214份，包括野生稻材料24份，籼稻材料133份，粳稻材料57份。

为验证前期泛基因组数据锁定的候选HAK基因的功能，本研究对178份BC₃F₈渗入系群体开展苗期盐胁迫表型初筛。试验采用完全随机设计，每份材料设3组生物学重复，每组重复24株。种子经消毒催芽后，播种于96孔PCR板中水培。待幼苗生长至二叶一心期时，将其划分为2组：对照组持续使用正常营养液培养，处理组则转入含有175 mmol·L⁻¹ NaCl的营养液中进行盐胁迫处理。连续胁迫处理9 d后，处理组与对照组间呈现出显著的耐盐表型差异，将处理组转移至正常培养液中恢复生长7 d。通过统计幼苗存活率，筛选出耐盐性显著优于对照的候选材料。将初筛获得的高抗材料表型与全基因组重测序及渗入片段进行分析，结合前期泛基因组数据分析结果，锁定了3个在驯化中受强烈选择的候选基因（OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13），最终从178份渗入系群体中筛选出分别携带云南元江普通野生稻来源OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13基因区段且耐盐表型较为稳定的材料9YJ-12、9YJ-97和9YJ-100，作为渗入系材料。

对上述3份核心渗入系材料及对照品种‘9311’开展苗期耐盐性复筛试验。当幼苗二叶一心期时，将处理组幼苗转入含150 mM NaCl的营养液中持续胁迫14 d，对照组则正常培养。胁迫结束后将所有幼苗转移至正常营养液中恢复7 d。详细记录植株的受害表型及恢复情况并统计最终存活率。所得数据采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析与显著性检验。

取复筛验证后的渗入系9YJ-12、9YJ-97、9YJ-100和对照材料‘9311’的新鲜叶片1 g，液氮速冻后充分研磨，使用Solarbio公司的2×CTAB提取缓冲液并参照其说明书进行基因组DNA的提取与纯化。

利用Phytozome数据库（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）获取OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13的参考序列，分段设计覆盖各基因编码序列（coding sequence，CDS）的特异性引物。所有引物均由擎科生物技术有限公司合成，引物序列详见表2。以9YJ-12、9YJ-97和9YJ-100的DNA为模板分段进行扩增，扩增体系为DNA模板1 µL（200 ng）、100 µmol·L⁻¹ Primer F/R各1 µL、ApexHF HS DNA Polymerase CL 1 µL、2×ApexHF CL Buffer 10 µL、H₂O 6 µL，总体积20 µL。扩增程序：94℃预变性2 min，98℃变性10 s、60℃退火15 s、68℃延伸40 s（延伸时间根据产物长度按1 kb·min⁻¹调整），35个循环，最后68℃终延伸10 min。取3µL PCR产物，使用1%的琼脂糖凝胶（含GelRed染料）进行电泳检测，将目的条带清晰、无杂带的扩增产物送至有康生物有限公司进行双向测序。

根据OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13基因组序列比对结果，以CDS变异为多态性标记构建单倍型，并使用NETWORK v10软件通过中介网络法构建单倍型网络图来分析单倍型间的进化关系，ε参数设置为0（最简约网络）。

为了探索HAK家族基因在水稻驯化过程中是否受到人工选择，本研究从水稻超级泛基因组信息资源数据库中下载了27个HAK家族基因的基因组序列，并对其进行核苷酸多态性（π）及Tajima’s D值分析。

全家族的群体遗传学分析结果显示，HAK家族成员在水稻演化过程中经历了显著的亚种分化与选择性清除（表3～7）。具体而言，在整个栽培稻群体中，仅OsHAK7基因的核苷酸多态性相较于野生稻显著下降，且Tajima’s D值为−2.795 89（P < 0.001），表明该基因在早期驯化中受到了强烈的定向选择（表3）。在籼稻群体中，OsHAK5、OsHAK7、OsHAK8、OsHAK14、OsHAK15、OsHAK18、OsHAK20、OsHAK23基因均受到不同程度的选择，但仅OsHAK7基因受到强烈的选择（表3～7）。在粳稻群体中，OsHAK3、OsHAK5、OsHAK6、OsHAK7、OsHAK8、OsHAK9、OsHAK13、OsHAK15、OsHAK17、OsHAK18、OsHAK19、OsHAK20、OsHAK21、OsHAK22、OsHAK23、OsHAK27均受到不同程度的选择（Tajima’s D均小于−2.0，P < 0.01），其中，OsHAK13、OsHAK21、OsHAK27、OsHAK18、OsHAK9基因受选择程度最为强烈（表3～7）。

群体序列分析从基因组学层面揭示了HAK家族基因在水稻驯化过程中的演化特征。然而，单纯的生物信息学推断不足以明确这些自然变异的实际生物学效应。为了进一步验证上述HAK家族基因的功能，本研究以‘9311’为对照，对178份BC₃F₈渗入系进行175 mmol·L⁻¹ NaCl极端盐胁迫表型鉴定。幼苗长至二叶一心期时进行盐处理，持续胁迫9 d后，转入正常营养液恢复7 d并统计存活率。图1结果显示，‘9311’对胁迫高度敏感，恢复期出现大面积枯死，最终存活率仅为3.5%。而渗入系群体的耐盐表型出现显著遗传分离。以20.0%为存活率为阈值，初筛共鉴定出17份耐盐表现突出的候选材料。将这17份材料的表型数据与全基因组重测序及渗入片段进行分析。结果显示，渗入系9YJ-12、9YJ-97和9YJ-100的染色体导入区段精准覆盖了OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13所在的野生稻单倍型物理区间。基于此，确定这3份材料为后续机制研究的核心实验材料。

Figure 1.  Initial screening of seedling salt tolerance in introgression lines and survival rate analysis of candidate lines

为系统验证野生稻靶基因导入区段的耐盐稳定性，本研究对携有云南元江普通野生稻OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13基因的3份渗入系9YJ-12、9YJ-97和9YJ-100以及对照‘9311’开展150 mmol·L⁻¹ NaCl盐胁迫复筛。在两叶一心期对4份材料用150 mmol·L⁻¹ NaCl营养液处理14 d，28℃条件下恢复生长7 d，统计存活率。结果显示，9YJ-12、9YJ-97、9YJ-100的存活率分别为69%、54%、73%，相较于对照‘9311’（18%）分别显著提高了51%、36%、55%（图2）。研究结果表明，携有云南元江普通野生稻OsHAK7、OsHAK9、OsHAK13基因的渗入系能显著增强水稻耐盐性。

Figure 2.  Phenotypic analysis of salt tolerance of ‘9311’ and the core introgression lines

鉴于云南元江普通野生稻中的OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13等位基因可能具有耐盐功能，本研究对这3个基因在野生稻和栽培稻中的序列变异进行了系统分析。OsHAK7（LOC_Os07g47350）基因全长5 563 bp，编码区长度为2 436 bp。对211份水稻种质基因组序列分析结果显示，OsHAK7基因的编码区存在17处核苷酸变异，包括4个插入/缺失变异（Insertion/Deletion，InDel）和13个单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）变异（图3）。其中，4个InDel分别于编码区第10 bp和第15 bp插入28个和4个碱基、第1783 bp插入1个碱基以及第1900 bp缺失3个碱基；13个SNP位点均引起了氨基酸发生变化，这13个氨基酸变化分别位于以下位置：第4位（Tyr/Phe）、第5位（Gln/Lys）、第16位（Asp/Ser）、第153位（Thr/Met）、第156位（Gln/His）、第161位（Gly/Val）、第241位（Arg/Gln）、第356位（Glu/Gln）、第399位（Ser/Phe）、第442位（Thr/Met）、第479位（Ala/Thr）、第721位（Arg/Gln）和第756位（Tyr/His）（图3）。

Figure 3.  Nucleotide diversity of the OsHAK7 gene coding sequence

OsHAK9（LOC_Os07g48130）基因全长5 542 bp，编码区长度为2 367 bp。对211份水稻种质基因组序列分析表明，在OsHAK9基因的编码区共存在6处核苷酸变异，包括1个InDel和5个SNP变异。其中，1个InDel于编码区第206 6 bp插入6个碱基；5个SNP位点均引起了氨基酸的变化，分别位于编码区第670位、第745位、第1 424位、第1 913位和第2 027位各存在1个单碱基替换，均引起相应位置的氨基酸发生改变（图4）。

Figure 4.  Nucleotide diversity of the OsHAK9 gene coding sequence

OsHAK13（LOC_Os06g45940）基因在17份野生稻材料中存在缺失。OsHAK13基因全长7 530 bp，编码区长度为2 337 bp。对197份水稻种质基因组序列分析结果显示，OsHAK13编码区存在6处核苷酸变异，包括2个InDel和4个SNP变异。其中，2个InDel分别为编码区第34 bp 存在5～12个碱基的片段插入以及第2104 bp存在9个碱基的缺失；4个SNP位点引起了氨基酸的变化，分别位于以下位置：第43位（Cys/His）、第330位（Glu/Lys）、第646位（Gly/Cys）和第689位（Arg/Lys）（图5）。

Figure 5.  Nucleotide diversity of the OsHAK13 gene coding sequence

根据上述OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13基因序列变异分析的结果，利用各基因编码区的序列变异作为多态性标记，分别构建3个基因的单倍型网络。为避免低频单倍型对网络拓扑结构的干扰，本研究仅保留样本出现频率≥2的主效单倍型用于单倍型网络构建，以便更清晰地解析核心单倍型间的进化关系与连锁特征。在21份野生稻中，OsHAK7基因存在16种单倍型（Hap1～Hap16）；在132份籼稻和58份粳稻中，共有12种单倍型（Hap9，Hap17～Hap27），主要为Hap9，在籼稻和粳稻中分别占比87.9%、81.0%。单倍型分析结果显示栽培稻中的OsHAK7基因均来自野生稻中的Hap9或由野生稻中的Hap9突变而来（图6-A）。在24份野生稻中，OsHAK9基因存在6种单倍型（Hap1～Hap6）；在129份籼稻和58份粳稻中，共有6种单倍型（Hap2，Hap7～Hap11），主要为Hap2，在籼稻和粳稻中分别占比71.3%、98.3%。单倍型分析结果显示粳稻中的OsHAK9基因均来自野生稻中的Hap2，籼稻中的OsHAK9基因源自野生稻中的Hap2单倍型或由其突变而来（图6-B）。在7份野生稻中，OsHAK13基因存在7种单倍型（Hap1～Hap7）；在133份籼稻和57份粳稻中，共有8种单倍型（Hap5、Hap8～Hap14），主要为Hap5，在籼稻和粳稻中分别占比81.2%和100%。单倍型分析结果显示粳稻中的OsHAK13基因均为野生稻中的Hap5类型，籼稻中的OsHAK13基因源自野生稻中的Hap5类型或由其突变而来（图6-C）。

Figure 6.  gene coding region haplotypes

上述结果表明OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13在驯化过程中受到不同程度的定向选择。为了进一步探索这3个基因的分子演化规律，本研究对9YJ-12（OsHAK7）、9YJ-100（OsHAK9）、9YJ-97（OsHAK13）、‘9311’（OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13）及Nipponbare（OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13）中这3个基因的编码区进行了克隆测序。测序结果显示OsHAK7基因编码区在9YJ-12、‘9311’和Nipponbare中无差异；OsHAK9基因编码区在‘9311’和Nipponbare中无差异，9YJ-100中第474 bp插入1个碱基，导致移码突变；OsHAK13基因编码区在9YJ-97、‘9311’和Nipponbare中无差异。以上结果表明，野生稻的这3个基因在编码区检测到的自然变异，尚不足以全面解释其在驯化过程中的受选择信号及耐盐性差异。为了验证这一推测，本研究根据前人的报道查询水稻基因组选择性清除区域发现栽培稻在其第7号染色体物理位置28.8 Mb～29.0 Mb（国际水稻基因组测序计划第4版，IRGSP 4）区间、第6号染色体物理位置28.5 Mb～28.7 Mb（IRGSP 4）区间均存在选择性清除区域，与其关联的性状均为粒长/粒重（表8） ^[26]。而OsHAK7和OsHAK9基因位于第7号染色体物理位置28.8 Mb～29.0 Mb（IRGSP 4）选择性清除区域内或边缘，OsHAK13基因则位于6号染色体物理位置28.6 Mb～28.7 Mb（IRGSP 4）选择性清除区域内（表8）。鉴于上述结果，推测这3个基因可能位于基因组中的选择性清除区域，因为“搭车效应”而被定向选择。

本研究揭示了HAK家族OsHAK7、OsHAK9与OsHAK13基因的序列变异特征及其与水稻耐盐性的关系，为解析这些钾转运蛋白编码基因在水稻驯化过程中的分子演化规律提供了新线索。群体遗传分析显示，OsHAK7、OsHAK9及OsHAK13基因在野生稻中保持了丰富的等位变异与较高的遗传多样性，而在栽培稻中，其序列多态性水平显著降低，π值下降达1～2个数量级。粳稻亚种中的核苷酸多样性下降尤为突出，其π值（0.000 14～0.000 27）不仅显著低于籼稻，也远低于也远低于水稻全基因组背景的平均多态性水平（0.000 50～0.001 70） ^[26]。这种遗传多样性的急剧下降与驯化过程中的定向选择密切相关 ^[27]。结合前文单倍型网络分析中栽培稻高度富集于单一或少数核心单倍型的分布特征，可以推断这3个基因在驯化过程中经历了选择性清除（selective sweep） ^[28]。

人们在水稻驯化过程中对高产（如粒长、粒宽、千粒重及穗粒数）等重要农艺性状的强烈选择，促使关键的驯化基因在群体中迅速固定。由于连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）的作用，位于这些驯化基因附近同一染色体区块的OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13基因，可能通过“搭车效应”而被间接固定。这种伴随选择性清除的过程，降低了周边的核苷酸多样性，导致野生稻中一些与耐逆相关的有利等位基因在长期的育种过程中被无意丢失，加剧了栽培稻遗传基础的狭窄化。进一步的基因组分析表明，OsHAK7和OsHAK9基因分别位于已知驯化基因FZP上游约12.5 kb与441.9 kb处。FZP基因是穗枝梗发育的关键调控因子，在驯化过程中受到强烈选择 ^[29]。由于连锁不平衡的作用，对FZP基因的选择导致其周边大片段基因组区域的多样性被“拖带”固定。对于OsHAK13基因，序列分析表明其栽培稻优势单倍型（Hap5）与野生稻单倍型在编码区未出现导致蛋白质结构显著变化的非同义突变，结合该基因在盐胁迫下呈现的强烈转录响应特征，其在栽培稻中被高度保留的机制可能存在两种情况：其一是该基因在调控钾离子稳态或参与其他胁迫响应通路时，因基因多效性间接影响了产量等农艺性状，从而在驯化中被保留。其二是该基因恰好与某个尚未鉴定的受到强烈选择的驯化基因紧密连锁，从而在遗传重组中通过“搭车效应”被间接固定。

在云南元江普通野生稻中，本研究检测到OsHAK9基因编码区第474 bp处存在单碱基（1 bp）插入。而OsHAK7和OsHAK13在元江野生稻与栽培稻‘9311’之间仅检测到同义突变。虽然同义突变也可能通过改变mRNA稳定性、翻译效率或蛋白质空间结构间接影响耐盐性，但仅凭上述单一变异，难以完全解释携带这些野生稻来源区段的渗入系在盐胁迫下表现出的显著耐盐性提升。进一步印证了本研究利用染色体片段渗入系所评估的耐盐性，反映的是导入的大片段染色体区段的综合遗传效应，而非单一突变位点的直接遗传效应。受限于群体内的重组频率与连锁累赘（linkage drag），野生稻导入片段不可避免地包含了共渗入（co-introgression）区段内尚未鉴定的顺式调控元件，或是与该区段紧密连锁的其他未知耐盐相关基因的协同互作。基于钾转运蛋白保守功能与前期转录响应特征，本研究认为OsHAK7、OsHAK9和OsHAK13基因所在区间可能在水稻驯化过程中受到了定向选择，但仅凭渗入系表型无法排除旁侧连锁基因的干扰。未来亟需构建次级分离群体以缩减候选物理区间，并结合CRISPR/Cas9靶向敲除与转基因互补等反向遗传学手段，最终剔除紧密连锁基因的遗传干扰，实现对野生稻优异耐盐等位基因功能的精准验证。

为客观解析野生稻染色体片段的耐盐遗传效应，本研究选取水稻苗期存活率作为核心鉴定指标。苗期是水稻抵御渗透胁迫与离子毒害最敏感的生长阶段，该时期耐盐性鉴定结果，可直观反映植株维持体内离子稳态、构建早期抗氧化防御体系的综合能力 ^[30-31]。在 150 mmol·L^-1 NaCl 盐胁迫条件下，渗入系 9YJ-12、9YJ-97 与 9YJ-100 的耐盐能力均显著提升。由此说明，野生稻导入的基因组片段携带优良耐盐遗传因子，可通过调控离子平衡、提升活性氧清除效率、强化渗透调节等生理途径，弥补栽培稻进化过程中丢失的耐盐等位基因功能，进而重塑植株盐胁迫应答的遗传调控通路。值得注意的是，作物盐胁迫应答机制贯穿整个生长周期。受试验周期限制，本研究仅开展了苗期耐盐性分析，尚未针对抽穗、开花等生殖生长阶段进行系统性耐盐评价。后续可通过设置生殖生长期盐胁迫处理试验，结合结实率、产量等农艺性状测定，进一步探究水稻不同生育时期耐盐调控机制的差异，明确 OsHAK13 基因在生殖生长阶段的具体生物学功能。

综合而言，本研究系统阐明了水稻 HAK 家族基因在驯化进程中的分子演化特征，提出了“搭车效应”可能导致抗逆基因多样性丧失的演化机制；同时借助野生稻渗入系表型鉴定，证实野生稻种质中含有可显著提升栽培稻耐盐能力的优良等位基因与关键遗传区段。该研究结果不仅丰富了水稻耐盐分子演化的理论认知，也为耐盐水稻分子设计育种、优异耐盐种质挖掘与新品种创制提供了重要理论支撑和基因资源。