Identification of GH3 gene family and functional analysis of PcGH3-12 in Phytophthora capsici

辣椒疫霉菌LT1534菌株、ΔPcGH3-12突变体菌株、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株，以及CRISPR - Cas9体系相关载体的质粒（pYF515和pBluescript SK Ⅱ +）等，均保存于海南大学热带农林学院生物灾害绿色防控教育部重点实验室。

TA培养基（用于疫霉培养）：将番茄汁用纱布过滤至300 mL，添加3.5 g碳酸钙后，加入去离子水定容至3 L，每100 mL添加1.5 g琼脂粉，采用高压蒸汽灭菌法，于121℃灭菌20 min。

辣椒疫霉菌野生型LT1534及ΔPcGH3-12突变体菌株被置于10%固体TA斜面培养基中，于10～12℃的黑暗环境下保存。在使用时，将菌株置于TA培养基中，于25℃条件下进行活化培养。本试验所采用的辣椒种子HNUCB0226，由海南大学热带农林学院王志伟老师惠赠。西瓜、豌豆、番茄、南瓜、蚕豆等种子均保存于海南大学热带农林学院生物灾害绿色防控教育部重点实验室。连接酶购自诺唯赞公司；限制性内切酶购自New England Biolabs（NEB）公司；抗生素购自宝日医TAKARA公司；基因敲除相关试剂购自上海生工生物公司；试剂盒购自天根（TIANGEN）公司。

借助Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）所下载的GH3基因家族成员蛋白保守结构域的隐马尔科夫模型（PF00933），对辣椒疫霉LT1534菌株中的GH3基因家族成员展开筛选与鉴定，运用序列分析工具HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmer）对基因的结构域予以验证。采用TBtools绘制转录水平热图。通过对NCBI基因组数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中检索获取的其他物种的GH3基因家族成员结构域蛋白的氨基酸序列进行系统发育树制作与比对，利用IBS绘制结构域，并借助MEGA v11构建进化树，运用iTOL（https://itol.embl.de/）对进化树进行美化处理。

利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）对辣椒疫霉菌LT1534菌株中的GH3基因家族成员的蛋白序列开展理化性质分析。通过WoLF SPORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）、CELLO（http://cello.life.nctu.edu.tw）、Euk-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）3个不同数据库对辣椒疫霉菌GH3基因家族成员进行亚细胞定位的预测性分析。借助SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）和Alphafold 3（https://alphafoldserver.com/）进行同源建模，剖析辣椒疫霉菌GH3基因家族蛋白序列的三维结构特性，预测蛋白质的空间模型。

用于克隆扩增目标基因及其上下游同源臂片段的引物、用于PCR验证片段大小的引物以及sgRNA引物，均由北京擎科生物科技股份有限公司合成（表1）。

质粒pBluescript SK II+用于构建基因敲除载体，经Pspx Ⅰ和Spe I双酶切处理后，与待敲除目的基因的上下游同源臂片段进行连接，通过大肠杆菌DH5α转化验证，测序结果准确无误后，获得同源重组质粒。质粒pYF515用于构建sgRNA载体，PcGH3-12基因特异性sgRNA借助基于网络的真核病原体CRISPR-guide RNA/DNA设计工具（http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design）进行设计。扩增后的片段独立克隆并连接至经Bsa Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切处理后的pYF515质粒中，经大肠杆菌DH5α转化验证，测序正确后，得到sgRNA-pYF515载体质粒。采用聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化方法^[27]，将构建完成的pBS和pYF515质粒混合物转化至由辣椒疫霉菌LT1534菌株制备的原生质体中。将转化后的原生质体置于液体再生培养基（PM）中培养，并于25℃培养箱内黑暗条件下培养18 h。将转化体接种于含有50 μg/mL遗传霉素（G418）、100 μg/mL潮霉素的再生琼脂培养基（PAM）上，于25℃培养以预选具有G418抗性的菌丝。黑暗培养24～48 h后，补充含有G418和潮霉素的TA培养基作为第二筛选培养基，并于25℃黑暗条件下培养1～3 d。运用PCR、靶向限制性测序和第二代全基因组测序技术筛选潜在阳性的PcGH3-12基因敲除突变体。

采用10 μL移液枪头，自野生型LT1534、ΔPcGH3-12突变体以及EV菌株培养皿生长边缘的新鲜生长菌丝处进行连续打孔操作。将从单一菌株切下的菌丝体接种于90 mm TA琼脂培养板中央，于25℃条件下黑暗倒置培养4 d后，通过测量菌落直径来评估单一菌株的营养生长状况。每个菌株设置至少5个重复，开展至少3次独立试验。

将野生型LT1534、ΔPcGH3-12和EV菌株分别接种于10% TA琼脂培养基平板，统一于25℃黑暗倒置培养4 d后，去除封口膜，置于28℃光照培养箱中继续培养2 d以诱导孢子囊产生。使用2 mL ddH₂O刮洗菌丝和孢子囊，制备孢子囊悬浮液，吸取10 μL滴于血球计数板上，在显微镜下观察孢子囊形态并统计数量。每个菌株设置至少3个重复，开展至少3次独立试验。

将野生型LT1534、ΔPcGH3-12和EV菌株分别接种于插有载玻片的10% TA琼脂培养基中，于25℃下进行黑暗培养。分别在培养1、2、3和5 d时取出载玻片，在倒置显微镜下观察菌丝形态。

将野生型 LT1534、ΔPcGH3-12突变体及EV菌株从10% TA琼脂培养基平板上切取大小均一的菌块，转接至TA液体培养基中，在120 rpm、25℃条件下培养3 d。将等体积的菌丝球接种于活体辣椒植株无伤叶片正面中部表面，以空白琼脂块作为对照（Mock），先于25℃黑暗环境（湿度70%～90%）培养24 h，随后在25℃光照且保湿条件下培养2 d。待野生型出现完整病斑时，移除菌丝球，测量叶片病斑面积并拍照记录。每个处理选用3株辣椒苗（每株10片叶）进行重复试验，至少开展3次独立实验。

运用Microsoft Excel 2016开展数据整理工作，借助GraphPad Prism v9.0进行数据统计分析。采用单因素方差分析检验统计显著性。

基于辣椒疫霉菌LT1534的基因组数据，以GH3基因家族蛋白序列的保守结构域为靶向，运用隐马尔科夫模型开展检索，共计筛选出28个辣椒疫霉菌GH3基因家族成员（表2），并依据其在辣椒疫霉菌基因组中的基因位置依次予以命名。通过生物信息学手段分析可知，辣椒疫霉菌GH3基因家族编码产物的蛋白理化性质存在显著差异。其蛋白质序列长度介于575～877个氨基酸之间，分子量范围为62851.00～94035.28 Da。其中，PcGH3-9的氨基酸数目最少，分子量为62851.00 Da；而PcGH3-19是该家族中氨基酸数目最多的成员，分子量为94035.28 Da。

进一步分析表明，辣椒疫霉菌的GH3基因家族蛋白大多为酸性蛋白。其中，PcGH3-26蛋白的等电点最高，达到7.53；而PcGH3-19蛋白的等电点最低，仅为4.44；PcGH3-12等电点为4.54，在基因家族成员中相对较低，属于酸性蛋白。辣椒疫霉菌GH3蛋白的不稳定系数范围为22.25～38.34，且不稳定系数均低于40。依据蛋白质稳定性分类标准，这表明该基因家族编码的蛋白质均属于稳定蛋白。

在热力学稳定性方面，辣椒疫霉菌GH3蛋白的脂肪系数范围为80.94～92.98。其中，PcGH3-21的脂肪系数最低，意味着其热稳定性最差；而PcGH3-16的脂肪系数最高，表明该蛋白热稳定性最佳；PcGH3-12脂肪系数较高，其热稳定性相对较优。此外，亲水性分析显示，所有GH3蛋白的平均亲水系数均为负值，这表明该家族成员整体呈现典型的亲水性特征，此特性可能与其在胞外基质的催化功能密切相关。

另外，基于WoLF PSORT、Euk-mPLoc及CELLO三个数据库的综合分析，对辣椒疫霉菌GH3基因家族成员的亚细胞定位进行预测，绝大部分蛋白均为胞外蛋白（表3）。

利用SWISS-MODEL和Alphafold 3对辣椒疫霉菌PcGH3蛋白进行同源建模，结果显示，28个GH3蛋白可大致分为2个构型（图1）。其中，PcGH3-1、PcGH3-3、PcGH3-4、PcGH3-6、PcGH3-7、PcGH3-8、PcGH3-9、PcGH3-12、PcGH3-13、PcGH3-14、PcGH3-15、PcGH3-17、PcGH3-18、PcGH3-20、PcGH3-22、PcGH3-23、PcGH3-24、PcGH3-26和PcGH3-28具有相似的三角形蛋白构型，其中，PcGH3-12蛋白结构两端排序相对紧实有序；PcGH3-2、PcGH3-5、PcGH3-10、PcGH3-11、PcGH3-16、PcGH3-19、PcGH3-21、PcGH3-25和PcGH3-27的蛋白构型形似四边形。

Figure 1.  Protein tertiary structure of GH3 gene family members in P. capsici

通过对辣椒疫霉菌GH3基因家族蛋白结构域分析，发现28个基因均具有完整结构域，PcGH3-12、PcGH3-10、PcGH3-7等蛋白结构中的糖苷水解酶家族3-N末端结构域（GH 3 N-terminal）位于该蛋白结构的起始端（图2）。蛋白序列特征分析表明，除了本研究发现的保守的GH3结构域外，还具有纤连蛋白Ⅲ型类似结构域（Fibronectin type Ⅲ- like）（图2），Fn3结构域在蛋白质中发挥着关键作用，主要体现在介导蛋白质之间的相互作用，通过维持蛋白质的稳定构象，确保蛋白质功能的正常发挥^[28]，同时，Fn3结构域能够促进酶催化结构域与底物或小分子的结合，进而推动酶促反应的顺利进行^{[29, 30]}。

Figure 2.  Functional domains of GH3 gene family members in P. capsici

辣椒疫霉菌GH3基因家族中28个基因成员通过NCBI的位点特异性迭代BLAST（Position-Specific Iterated BLAST）经过多次迭代和位置特异性矩阵的更新获得其它物种的蛋白序列，筛选后使用在线软件MEME进行保守基序分析，将基序数设置为10，将其命名为Motif1-Motif10。分析结果发现28个辣椒疫霉菌GH3基因家族成员之间包含的保守基序数目和种类存在差异，其中Motif2、Motif3、Motif10是最保守的基序，存在于28个PcGH3成员中；6个PcGH3含有10个基序，PcGH3-9含有的基序最少，仅含有4个基序。PcGH3-12、PcGH3-14、PcGH3-18含有两个Motif8。此外，一些家族成员表现出相似的Motif组成，说明这些成员的基因功能上可能也同样具有较高的相似性（图3）。

Figure 3.  PcGH3 protein and motif structure of different species and 10 conserved motifs domains

本研究通过辣椒疫霉菌LT1534菌株侵染辣椒、番茄、蚕豆、西葫芦、菜豆和西瓜叶片的互作转录组，筛选出在侵染不同寄主及不同时段的转录水平有显著上调的基因。比较分析发现，PcGH3-10、PcGH3-12在辣椒、番茄、蚕豆、西葫芦、菜豆和西瓜幼苗互作的早期（8～24 h）和晚期（36～72 h）表达强度相对较高，后续对PcGH3-12基因进行敲除，进行初步基因功能验证（图4）。

Figure 4.  Transcription level of GH3 gene family members of P. capsici infecting different hosts

辣椒疫霉菌GH3基因家族中的PcGH3-12通过NCBI的位点特异性迭代BLAST（Position-Specific Iterated BLAST）及反向BLASTp后检索得到44个物种（表4），进一步的系统进化发育表明，PcGH3-12与P. cactorum和P. infestans具有共同的进化关系。但与P. sojae存在一定的进化距离（图5）。同时，除了GH3结构域外，同样大部分也具有Fibronectin typeⅢ-like结构域（图5）。

Figure 5.  Phylogenetic tree of GH3 gene family members of P. capsici

本研究通过同源重组及CRISPR-Cas9技术（图6-A），经过抗性筛选，用CTAB法提取候选突变体的DNA，使用引物（表1）验证PcGH3-12的ORF，进一步用引物（表1）扩增候选突变体的DNA并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序（图6-B），并将菌丝送往武汉万摩科技有限公司进行全基因组测序（图6-C）。通过测序验证，获得了PcGH3-12的三个敲除突变体，分别命名为∆PcGH3-12-169、∆PcGH3-12-187、PcGH3-12-127^∆169-2411，其中∆PcGH3-12-169、∆PcGH3-12-187全敲突变体，PcGH3-12-127^∆169-2411为敲除编辑突变体，仅部分点位被敲除。

Figure 6.  Verification of PcGH3-12 knockout transformants

菌丝的发育对辣椒疫霉菌的成功侵染至关重要。为了确定PcGH3-12对辣椒疫霉菌营养生长的影响，将野生型LT1534、突变体菌株∆PcGH3-12-169、∆PcGH3-12-187、PcGH3-12-127 ^∆169-2411以及EV菌株分别接种到TA培养基上25℃避光培养4 d后，观察菌落形态并测量菌落直径，结果显示，LT1534、EV、∆PcGH3-12-169、∆PcGH3-12-187和PcGH3-12-127^∆169-2411菌株的生长直径分别为：72.74±0.47 mm、74.28±0.63 mm、18.18±0.52 mm、12.67±0.82 mm和42.52±0.43 mm，在营养充足的生长条件下，突变菌株的生长速度明显慢于野生型菌株，突变体菌株的菌落形态无明显差异（图7）。

Figure 7.  Deletion of PcGH3-12 affects the vegetative growth of P. capsici

辣椒疫病是一种典型的多周期疫病，该菌的无性繁殖孢子是其传播致病关键环节。为明确PcGH3-12基因对无性生殖的影响，将野生型菌株和突变体菌株在25℃黑暗下培养4 d后，28℃光照条件下诱导2 d使辣椒疫霉菌产孢，收集孢子囊悬浮液后，对菌株产生的孢子囊进行了定量和定性评价。统计结果显示，同样单位面积下，10 μL孢子囊悬浮液中LT1534、EV、∆PcGH3-12-169、∆PcGH3-12-187和PcGH3-12-127^∆169-2411菌株孢子囊数量分别为：229.67±40.83、222.11±26.45、0.67±0.33、0和0.22±0.19个，ΔPcGH3-12突变体菌株产生的孢子囊数量显著减少，孢子囊形态保持不变（图8）。结果表明，PcGH3-12基因的缺失严重影响了辣椒疫霉菌产生孢子囊的能力。PcGH3-12在辣椒疫霉菌的无性繁殖中发挥着重要的调控作用。

Figure 8.  The deletion of PcGH3-12 in P. capsici resulted in significant decrease in sporulation ability

为探究PcGH3-12在辣椒疫霉菌致病过程中的作用，将液体培养基培养后的野生型LT1534、ΔPcGH3-12突变体菌株和空载体对照EV菌株的菌丝体分别接种于感病辣椒品种HNUCB0226的叶前组织上。病斑面积数据分析显示，LT1534、EV、∆PcGH3-12-169、∆PcGH3-12-187 和PcGH3-12-127 ^∆169-2411菌株的病斑面积分别为：527.15±239.77、422.06±145.48、48.04±35.55、27.87±19.09和109.10±65.62 mm²，与野生型LT1534和空载体EV菌株相比，ΔPcGH3-12突变体菌株表现出明显的毒力缺陷，显著抑制辣椒疫霉菌的致病性（图9），表明PcGH3-12的缺失对辣椒疫霉菌的致病性有一定的影响。

Figure 9.  PcGH3-12 is involved in the pathogenicity of P. capsici

在产孢实验中，观察到突变体的菌丝形态发生了改变，对野生型和突变体菌株的菌丝进行了不同时间段的观察。与辣椒疫霉菌野生型LT1534菌株和EV菌株相比，ΔPcGH3-12突变体的菌丝形态存在明显差异，表现为孢囊梗分叉速度加快，孢囊梗顶端发育孢子囊将其释放到外界，与病原菌的致病扩散策略密切相关。实验表明PcGH3-12基因参与调控孢囊梗的生长（图10）。

Figure 10.  Deletion of PcGH3-12 accelerated the bifurcation of P. capsici cysts (scale bar=20 μm)

GH3基因家族成员主要编码胞外β-葡萄糖苷酶，在纤维素降解进程中发挥关键作用，有利于病原菌更高效地侵染寄主。基于此，本研究对辣椒疫霉菌中的GH3基因家族成员开展鉴定工作，系统剖析了辣椒疫霉菌中28个GH3基因家族成员的基因结构、理化特性、亚细胞定位以及转录水平，并通过敲除PcGH3-12来评估GH3在辣椒疫霉菌中的活性特征与生物学意义。

已有研究报道了灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）中一个编码属于糖基水解酶家族11的内切β-1,4-木聚糖酶的基因xyn11A，证明由木聚糖诱导并被葡萄糖抑制，敲除该基因导致其生长速率适度下降^[31]。同样的，本研究敲除PcGH3-12基因后，辣椒疫霉菌的营养生长显著受到抑制，表明PcGH3-12在辣椒疫霉菌的生长过程中发挥了关键作用。作为辣椒疫霉菌GH3家族成员，PcGH3-12基因可能参与了能量获取、物质运输等与生长相关的代谢过程，这些都对辣椒疫霉菌的存活和繁殖至关重要。此外，PcGH3-12基因的缺失可能导致糖苷水解酶在辣椒疫霉细胞间的交流受阻，从而影响辣椒疫霉菌的生长节律。

已有研究证明，纤维素酶CLR1是许多真菌作为唯一碳源的生长所必需的，CLR1基因突变体使纤维素酶活性的降低，严重损害了尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）腐生生长期间的纤维素代谢，显著抑制其产生小分生孢子^[32]。敲除轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioides）中GH3家族基因FvGH3-6，降低了该菌孢子的形成能力，与野生型相比，FvGH3-6敲除突变体对玉米谷物和茎的致病性较弱，这表明GH3基因家族参与了该菌的致病性，而FvGH3-6在F. verticillioides的分生孢子生成和致病性中发挥了重要作用^[33]。在本研究中，PcGH3-12基因的缺失同样极大地影响孢子的产生，另外还使得辣椒疫霉菌的孢囊梗分叉速度明显加快。而孢囊梗在无性繁殖过程中发挥关键作用，促进物种的繁殖，极有可能是孢囊梗的生长影响到辣椒疫霉菌的产孢。

近年来，糖苷水解酶家族的细胞壁降解酶在真菌和卵菌对植物宿主的入侵、致病性或毒性中的作用已经得到证实，但确切的机制仍然知之甚少^[34]。研究表明，果胶酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、纤维素酶和几丁质酶与真菌的致病性有关^{[35, 36]}。红球丛赤壳（Nectria hematococca）中果胶酸裂解酶基因的破坏导致豌豆致病性降低^[37]。纤维素酶、木聚糖酶和角质酶在稻瘟菌（M. oryzae）的毒性中起着至关重要的作用^[38]。在本研究中，PcGH3-12基因敲除突变体的致病力低于野生型，在致病性中起到了关键作用，然而，关于PcGH3-12基因的致病机制尚不清楚，值得进一步深入研究。

本研究通过生物信息学分析鉴定了辣椒疫霉菌中GH3基因家族成员，并利用同源重组和CRISPR-Cas9技术敲除了其家族成员PcGH3-12，并对其进行表型实验分析。ΔPcGH3-12敲除突变体与野生型相比，其营养生长受到抑制且孢子囊产量显著降低，同时孢囊梗分叉速度明显加快。致病性测定发现ΔPcGH3-12敲除突变体的致病力低于野生型。研究表明，PcGH3-12在辣椒疫霉菌的生长发育和致病过程中发挥关键作用，为进一步解析GH3基因家族对卵菌致病过程的调控提供了理论依据。