In Vitro culture of hybrid embryos from windfall fruits of oil-tea Camellia in Hainan caused by typhoon

2025年8月下旬，强台风“剑鱼”登陆3 d后，于海南大学儋州校区热带油茶“三圃一园”收集以越南油茶为父本，以海南本地油茶良种为母本，杂交后约 246 d 的杂交落果Ⅰ～Ⅷ号为外植体材料。落果擦拭干净带回实验室备用。

观测油茶果外观性状，采用游标卡尺测量果实的纵径与横径，使用天平称量单果质量；剥开果壳后，记录果实内种子数量，并逐一称量每粒种子的质量。每个试验组合设4～5次重复。完成各项数据测定后，将油茶果与种子置于阴凉处暂存备用。果形指数计算公式为：

式中，果高指果实纵轴长度，果径指果实横轴直径。根据指数大小可将果形划分为3类：指数>1 为长果型（如橄榄形、纺锤形），表明果实纵向延伸；指数 ≈ 1 为圆果型（如球形、扁球形），表明果实纵横相近；指数<1 为扁果型（如柿饼形），表明果实横向扩展。

将带回的杂交果用小铁锤轻轻敲开果壳和种壳，取出未成熟的种子，在超净工作台上，先用体积分数75 %的乙醇浸泡油茶籽45 s，无菌水冲洗1遍，然后以质量分数2 % 的NaClO消毒15 min，无菌水冲洗4～5遍。用手术刀和镊子剥取未成熟胚的胚芽，然后接种到胚萌发培养基（germination medium, GM）上诱导胚萌发；将未成熟胚的子叶切成约0.3 cm×0.3 cm×0.1 cm的薄片，接种在初代启动诱导培养基（initial induction medium, IIM）上进行分生结节诱导。30 d后，统计胚萌发率、分生结节诱导率，并将已诱导形成的初代分生结节转到增殖培养基（proliferation medium, PM）上增殖扩繁；第60天统计分生结节增殖系数，并将分生结节转到分化再生培养基（differentiation medium, DM）上，诱导分生结节和体胚萌发、不定芽分化；第90天统计观测分生结节的分化和再生情况，并将分生结节苗、体胚苗转接至植株再生培养基（regeneration medium, RM ）或将不定芽转接至芽扩繁培养基（shoot multiplication medium, SMM）上增殖扩繁，同时观测其生长情况。

以上各生长阶段培养温度（25±2）℃，除外植体接种后一周内暗培养，其余时间每天光照14 h，光照强度1500～2000 lx，空气相对湿度（70±5）%。

由于油茶不定芽转接易出现褐化现象，为了筛选优化芽增殖培养基，在原分化再生培养基DM的基础上，以3种不同的基本培养基以及3种不同浓度的植物生长调节剂，进行4因素3水平L₉（3 ⁴ ）的正交试验设置，培养30 d后，观测其形态和增殖生长情况。

具体培养基配方详见表1～2。培养基均添加30 g·L⁻¹糖+2.3 g·L⁻¹凝胶，pH5.8，于121℃、0.1 MPa压力，维持 20 min灭菌；需添加吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA₃）和玉米素（ZT）的培养基，待培养基凉至65℃时，添加经过滤灭菌的植物激素，摇匀后分装。

选取长势良好的杂交种胚外植体（Ⅳ号）分化培养材料，采用筛选出的增殖效率最高的切接方式（带腋芽的茎段或顶芽），将不定芽转接到最佳增殖培养基（8号）上进行培养。分别于0 d（未切接）、15 d和25 d时，从培养瓶中的组培苗中随机收集不定芽，用无菌水冲洗干净表面附着的培养基，再用无菌剪刀剪下叶片，随机混合均匀。每个处理称取0.1 g叶片，将样品置于液氮中研磨成细粉，按编号分装入塑料离心管中。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，测定与酶促褐变相关的多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

采用Excel 2021进行数据统计，并用SPSS Statistics 25.0软件进行统计分析，结果以平均值和标准误表示。

从图1可知，所收集的杂交落果均是以越南油茶为父本，海南地区油茶优株为母本，8种杂交油茶果的果形指数均小于1，无或少畸形，无病斑或虫蛀，果实总体良好。杂交果中种子颗粒数平均在2.3～9.7个间，不同组合的差异明显，但所有杂交果的种子败育率均为零，说明以越南油茶为父本，海南地区油茶为母体的杂交亲和性非常好。种子质量与果实质量的比值通常称为“鲜出籽率”，是一个极其关键的经济指标。由表3可知，8种杂交组合的鲜出籽率范围为32.3%～50.6%，均显著高于普通实生林或低产林（<30%）。其中，组合Ⅱ、Ⅶ和Ⅷ表现最佳，其鲜出籽率可达50%左右。

Figure 1.  Fruit drop and seed phenotype observation of C. hainanica hybrids

杂种胚挽救是植物远缘杂交育种中克服杂种败育、挽救意外杂交落果等问题的关键技术。其培养效果通常从胚胎发育状况、植株再生能力以及遗传特性稳定性等方面进行评估。如表4所示，在相应培养基上培养30 d后，Ⅳ号杂种胚中有超过一半的胚芽能够正常萌发成苗，表现最佳；其次是Ⅰ号杂种胚，萌发率为37.8%，而其他杂种胚均未见胚芽萌发。在分生结节的诱导方面，所有杂交果的未成熟胚子叶切片在分生结节启动诱导培养基上均可诱导形成分生结节，但不同杂种胚之间存在显著差异。其中，Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ号杂种胚子叶的分生结节诱导能力最强，诱导率达37%以上；Ⅳ和Ⅷ号次之；而Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ号的诱导能力明显低于前述5种，尤其是Ⅱ和Ⅵ号诱导效率最低。如表4和图2所示，诱导获得的8种分生结节在适宜的PM增殖培养基上均能有效增殖，增殖系数为3～5，各材料间无显著差异。培养至90 d时，除Ⅱ和Ⅵ号的分生结节未能分化出再生植株外，其余杂种胚来源的分生结节均可通过直接发育、体细胞胚胎发生途径形成再生植株，或经器官发生途径产生不定芽。后续仍需针对不同杂种胚优化再生培养基的组成，以进一步提高其增殖效率。此外，培养过程中仅Ⅱ和Ⅵ号的分生结节出现褐化现象，其余材料均未观察到褐化。

Figure 2.  Differentiation and regeneration of cotyledon meristematic nodules at 90 d

继代材料经不同切取方式接种到不同培养上培养，由于培养基、接种方式以及褐化影响的不同，相互间增殖效果差异显著，部分处理因不定芽褐化致死，为进一步筛选优化芽增殖培养基，在原分化再生培养基DM的基础上，以分化优良的IV号杂种胚子叶分生结节不定芽为材料，对增殖培养基设计4因素3水平L₉（3 ⁴ ）的正交试验。如表5所示，增殖系数的极差大小为：Rk（1.29>1.09>1.02>0.84），对增殖系数影响的主次顺序为：基本培养基>ZT>IAA>GA₃；褐化率的极差大小为：Ri（30>21.53>16.86>8.14），对褐化率影响的主次顺序为：IAA>基本培养基>ZT>GA₃；以增殖系数的k值分析得到最优组合为8号培养基：WPM + 0.05 mg·L⁻¹ IAA + 2.00 mg·L⁻¹ GA₃+2.00 mg·L⁻¹ ZT。以褐化率i值分析得到最优组合为4号培养基：B₅+0.10 mg·L⁻¹ IAA + 1.00 mg·L⁻¹ GA₃ + 2.00 mg·L⁻¹ ZT。在油茶含腋芽茎段（或顶芽）离体培养中，不同植物生长激素组合对增殖系数和褐化率调控的影响存在显著差异。如表6中增殖系数方差所示，ZT对增殖系数的影响极显著，IAA和GA₃的影响显著，说明ZT是调控油茶腋芽茎段增殖效率的关键激素，而IAA与GA₃的作用次之，后续要再一步精细ZT浓度以优化增殖培养基；如表7褐化率方差分析所示，IAA和ZT对褐化率的影响极显著，而GA₃对褐化率无显著影响，可进一步优化IAA与ZT的浓度配比以减轻褐化程度。总体来看，WPM增殖效果优于MS和B₅，后续以WPM为主，重点优化ZT浓度并配合IAA与GA₃配比，以实现高增殖系数并减轻褐化。对于褐化严重乃至致死的杂交种，建议初代培养使用B₅培养基，增殖阶段再转入WPM，效果可能更佳。

如表8所示，分生结节来源的无菌不定芽在不同培养基上培养30 d后，其增殖与褐化情况存在显著差异。当不定芽芽长小于2 cm时，以2～3个完整丛芽接种于9号培养基上的增殖效果最佳，增殖系数达到2.67。而当芽长大于2 cm时，采用含腋芽的茎段或顶芽进行插接继代，以8号培养基最为适宜，此时增殖系数最高，可达3.5。相比之下，以MS为基本培养基的处理增殖效率最低，尤其在芽长超过2 cm时，需切取含腋芽茎段或顶芽进行接种，由于褐化严重或材料死亡等原因，增殖系数仅为0.63，显著低于其他培养基或接种方式。总体来看，在相同基本培养基条件下，采用含腋芽茎段或顶芽接种的材料较完整丛芽接种更易发生褐化，尤其在第1号培养基（以MS为基本培养基）上，褐化率高达96.7%。在3种基本培养基中，以WPM为基本培养基的处理，其材料的褐化程度显著低于MS和B5培养基。

油茶杂种胚分生结节分化不定芽是其分化再生的主要途径，不定芽通过切取含腋芽茎段或顶芽进行增殖继代，在合适的培养基上增殖系数高，但培养过程中褐变严重，充分了解与酶促褐化密切相关的多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性变化，对控制或消除褐变以提高组织培养效率至关重要。切取Ⅳ号杂交种胚分生结节分化芽（大于2 cm）的含腋芽茎段或顶芽，接种在筛选优化出的8号分化培养基上，依序在接种当天（0 d）、第15 d以及第25 d时观测如表6所示，在接种继代后15 d、25 d时，PPO活性呈现先升后降趋势，分别比接种当天显著提高近5倍、显著降低38.8%；POD活性呈现出急剧升高趋势，分别比0 d时显著增加2.1倍和3.7倍；PAL活性则呈现出先降后升趋势，分别比0 d时显著降低45.4%和显著增加45.8%。3种酶的活性根据时间的推移呈现出不同的动态特征，如图3所示，随着培养时间延长，部分耐受褐化的芽能生长正常、萌发新芽或抽长新梢，但也有部分遭受褐化损害的培养材料呈现出叶片不同程度水渍或坏死、芽基部切口周围组织老化、新芽生长受抑制或褐死以及芽最终枯死等不同程度褐化损害，会降低不定芽增殖效率。

Figure 3.  Response of different proliferated buds to browning during subculture of excised adventitious buds from meristematic nodules and axillary bud-containing stem segments

杂交育种是海南油茶良种选育的重要途径，然而每年8—10月的强台风常导致油茶杂交果严重脱落，极大地制约了杂交选育的进程。近年来，胚挽救技术已在作物、果树、蔬菜及园艺等多个领域得到广泛应用，其成功率受取材时间、亲本基因型、培养基成分与外源添加物等因素影响，其中以上因素为核心要素^[14]。胚培养技术在种质资源拓展、品种退化与抗性衰退防控、育种周期缩短、远缘杂交胚败育挽救以及幼胚萌发率提升等方面亦展现出重要应用价值^[15]。在实际生产中，有必要根据具体情况对培养基和培养条件进行适当调整，以优化不同杂种胚的挽救效果。在金光杏梅、柑橘属间杂交及软枣猕猴桃等物种的胚挽救研究中，亦证实各环节技术优化对胚挽救成败具有关键作用^[16-18]。

本研究以越南油茶为父本，海南本地油茶良种为母本进行杂交，所获得的杂种胚亲和性良好，但由于每年台风导致杂交果大量受损，严重影响杂交效率。课题组前期已建立海南油茶未成熟胚离体培养成熟技术^[12]。本试验中，选取8个杂交组合的落果杂种胚，通过提供适宜的离体营养和再生条件，有效促进其正常发育，多数获得杂交植株。以WPM为基本培养基，添加2 mg·L⁻¹ 6-BA、0.2 mg·L⁻¹ NAA、0.2 mg·L⁻¹ IAA和400 mg·L⁻¹ CH，能有效诱导分生结节的形成，增殖系数达3.1～5.0，并通过分生结节直接萌发、体胚萌发及不定芽分化等途径，成功获得8种杂种胚的离体再生材料。该方法有效保留了优良杂交遗传资源，为海南油茶杂交育种提供材料保障，提升了育种效率。培养过程中，Ⅳ号杂种胚中半数以上胚芽可顺利萌发成苗，I号次之，萌发率为37.8%。培养至90 d时，除Ⅱ号和Ⅵ号外，其余杂种胚子叶分生结节均能通过直接发育、体胚发生或器官发生途径形成再生植株。

油茶胚培养中，器官发生与体细胞胚胎发生途径的选择并非随机，而是由外植体内在胚性潜力与外部培养条件共同决定。外植体的发育时期与取材部位是决定再生途径的核心内因^[19]，植物生长调节剂作为关键外因，基因型差异则决定油茶胚性潜力的表现程度。不同品种或家系在胚培养再生途径方面存在显著差异。例如，“长林53号”幼胚体胚发生能力极强，诱导率接近100%；而普通油茶、海南白花油茶等则可在不同培养条件下分别启动体胚发生或器官发生^[12]，这与WOX、BBM、LEC等胚性相关基因的表达水平密切相关^[5]。本研究中出现的多种发生方式，可能与杂种胚活性、生理状态、激素配比、成熟度及基因型等多因素协同调控有关，共同影响体细胞的分化命运。

在植物组织培养中，褐变现象分为酶促褐变与非酶促褐变。木本植物较草本更易褐变，主要因其细胞中木质素、单宁等酚类物质含量较高^[20]。酶促褐变中，PPO、POD和PAL活性变化与褐化程度密切相关。PPO与POD协同参与氧化反应，其活性是决定褐变程度的关键因素；PAL则通过调控酚类物质的合成，间接促进褐变^[21]。接种材料在切接时，细胞结构被破坏，酚类物质外泄与PPO接触，激活PPO活性迅速升高，在氧气存在下将酚类氧化为醌类物质，后者进一步聚合形成黑色素，引发组织褐变^[22]。在油茶切接继代0～15 d内，不定芽切接材料酚类含量丰富，PPO活性持续显著高于初始水平，直接导致褐变，这与黄国文等^[23]在白花油茶叶片外植体褐变研究中的结果一致。阙生全等^[24]也指出，油茶组织中酚类含量高，PPO活性升高显著加速褐化进程。POD活性亦显著上升，协同加剧褐变，与冯金玲等^[25]在油茶嫁接口愈合研究中发现的POD在组织胁迫后期持续活跃、加剧损伤的结论一致。PAL在15 d时未显著升高，反而呈下降趋势，表明该阶段参与褐变的酚类主要源于切接芽体的原生酚类；至25 d时PAL活性显著升高，反映组织在褐化胁迫下启动防御反应。PAL作为酚类合成关键限速酶，其上调可能为后续酶促褐化提供更多底物，形成“防御—损伤”恶性循环。这与青钱柳、阿月浑子组培研究中抑制PAL活性可减轻褐变的结论形成对比^[27-28]，揭示PAL调控功能在不同植物中存在差异。

此外，POD还参与植物抗病反应及木质素合成。在油茶芽继代培养中，POD显著升高常伴随细胞壁加固或组织老化^[29]，既加剧褐变，又使切接处组织老化、吸收能力下降，造成双重伤害，加速材料褐化死亡。因此，在杂种胚扩繁培养中，可通过适宜方式抑制褐变相关酶活性，提高组培成功率。例如，在培养基中添加抗氧化剂（如VC、柠檬酸）或吸附剂，通过耗氧或吸附醌类物质阻断酶促反应链；适时更换培养基以减少醌类积累；或在整个培养周期中适当降低培养温度和光照强度，以减缓酶代谢活性，从而减轻褐变，提高杂种胚的挽救与扩繁效率。

本研究结果表明，海南油茶与越南油茶杂交总体上表现出良好的亲和性，杂交所得未成熟胚在以WPM为基本培养基的条件下，其子叶具备较强的离体再生能力，能够通过形成分生结节实现有效增殖与扩繁。进一步观察发现，分生结节可通过不定芽分化、结节直接萌发及体细胞胚胎发生等多种途径再生为完整植株。在后期以不定芽为主要扩繁途径时，建议选用芽长小于2 cm的2～3个丛芽进行接种；对于芽长超过2 cm的材料，可切取带腋芽的茎段或顶芽进行增殖，但此类操作易诱发PPO、POD及PAL协同作用导致的褐化现象，从而影响增殖效率。因此，宜筛选抗褐化能力较强的芽进行扩繁，或将继代时间控制在20 d以内，以减少褐化影响。

上述针对海南地区杂交落果中杂种胚分化与再生的研究结果，不仅为油茶杂交种质的离体保存与创新利用提供了材料保障，也为杂种胚的高效扩繁和遗传改良提供了理论依据和技术支撑。该研究有助于推动海南油茶杂交育种进程，同时也为其他油茶物种的杂种胚培养或挽救提供参考。