Differential impacts of danofloxacin on the thermal tolerance of two symbiodiniaceae species

实验所用虫黄藻Cladocopium sp. HNUC1-1（简称Cladocopium sp.）与Durusdinium sp. HNUD1-1（简称Durusdinium sp.）由本课题组分离自海南文昌铜鼓岭礁区和三亚鹿回头礁区采集的鹿角杯形珊瑚（Pocillopora damicornis）^[24]。将分离获得的虫黄藻接种于由过滤海水配制的L1培养基中，并置于温度为26℃、光照强度为110 μmol·m⁻²·s⁻¹、明暗周期L:D=12 h:12 h的光照培养箱中培养至对数生长期。随后，离心收集藻液，以6 000 cells·mL⁻¹的初始密度转接至250 mL新鲜L1培养基中。实验设置4个组别，各组条件及对应英文简写如下：对照组（26℃，无抗生素；control group, Con）、抗生素暴露组（26℃，添加终质量浓度为10 μg·L⁻¹的达氟沙星；antibiotic exposure group, ATB）、高温暴露组（32℃，无抗生素；high-temperature exposure group, HT）及联合暴露组（32℃，添加相同质量浓度的达氟沙星；combined exposure group, Comb）。每组设6个生物学重复，以评估不同暴露处理对两种虫黄藻生理指标的影响。

达氟沙星暴露浓度的选择基于环境调查和预实验结果：该质量浓度处于中国近海及珊瑚礁区水体中喹诺酮类抗生素的检出范围，且南海部分珊瑚礁区达氟沙星为主要检出组分^{[22−23, 25]}。预实验结果表明，该质量浓度在暴露周期内未引起虫黄藻的急性死亡，但可诱导显著的生理响应。

分别于暴露后第1天与第7天取1 mL均匀藻液，加入10 µL 鲁哥氏试剂（Lugol’s试剂）进行固定，随后使用赛吉计数板（Sedgewick-Rafter计数板）在光学显微镜（尼康，YS-100）下计数细胞总量。每个藻液重复计数3次，定义虫黄藻密度为每毫升藻液的细胞个数（个·mL⁻¹）。基于第1天（N₁）与第7天（N₂）的虫黄藻密度，按公式计算7日内的比生长速率（μ）：

在暴露后第7天，取3 mL均匀藻液，在对应暴露温度下进行30 min暗适应。随后在遮光条件下，采用叶绿素荧光仪（walz，Dual-PAM-100）测定虫黄藻的最大光量子产量（F_v/F_m），用于反映虫黄藻光合系统II（PSII）的光能转换效率及其光化学活性状态。

在暴露后第7天，取2 mL均匀藻液，5 000×g离心10 min收集藻细胞。弃上清，加入2 mL丙酮，充分混匀后置于4℃遮光环境中萃取48 h。萃取完成后，12 000×g离心10 min，取上清液，使用紫外分光光度计（美谱达，UV-1100）分别测定630 与663 nm波长处的吸光度。根据Hédouin等描述的方法计算叶绿素a与c₂的总含量，并标准化至单个虫黄藻细胞。

在暴露后第7天，使用ROS检测试剂盒（碧云天，Y061804），运用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针法测定ROS含量。取5 mL均匀藻液，1 000×g离心5 min收集藻细胞，去除上清液后加入1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS; 0.14 mol·L⁻¹ NaCl, 8 mmol·L⁻¹ Na₂HPO₄, 1.5 mmol·L⁻¹ KH₂PO₄和 3 mmol·L⁻¹ KCl; pH 7.4）稀释1 000倍后的DCFH-DA溶液，37℃避光孵育30 min。孵育结束后于1 000×g下离心5 min去除上清，再使用无菌过滤海水漂洗3次，彻底去除未进入细胞的荧光探针。最后使用酶标仪（美国伯腾仪器有限公司，Epoch）在激发波长485 nm、发射波长525 nm条件下测定样品荧光强度。将ROS的相对含量定义为相比于对照组的荧光强度^[26]。

在暴露后第7天，取30 mL均匀藻液。4℃、5 000×g离心15 min，去上清后加入1 mL预冷的PBS（pH 7.4）进行重悬，重复2次。加入100 µL直径为0.1 mm的氧化锆研磨珠，使用均质仪于6.0 Hz下破碎45 s，再冰浴2 min，重复操作3次。随后4℃、12 000×g离心3 min，收集上清液。分别采用BCA法蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，P0010）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成，A003）、总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒（碧云天，S0119）及半胱天冬酶3（Caspase3）活性检测试剂盒（凯基生物，KGA204）测定上清液中的蛋白浓度、MDA含量、T-AOC以及Caspase3的激活水平。

4.5.1软件中完成，显著性水平设定为P < 0.05。建立双因素方差分析模型，使用performance包进行正态性检验和方差齐性检验，对于不满足假设的数据，进行对数转换后重新分析。当主效应或交互作用显著时，使用emmeans包结合Tukey HSD校正，比较高温暴露组与对照组、联合暴露组与高温暴露组、联合暴露组与抗生素暴露组之间的显著差异性。

在高温和达氟沙星暴露后第7天，统计各组虫黄藻细胞的密度，并计算整个暴露周期的比生长速率（图1）。当不添加抗生素时，相比于对照组（0.113±0.029），高温暴露组Cladocopium sp.的比生长速率（0.066±0.011）显著下降了42.13%（P < 0.05）；在达氟沙星暴露后，联合暴露组的比生长速率（0.058±0.016）相比于抗生素暴露组（0.089±0.023）显著下降了34.29%（P < 0.05）。但是，高温暴露组与联合暴露组之间未检测到显著差异（P> 0.05）。

Figure 1.  Comparison of relative growth rates of Cladocopium sp. and Durusdinium sp. among different exposure groups

对于Durusdinium sp.的比生长速率，高温暴露组（0.061±0.011）和联合暴露组（0.037±0.017）分别显著低于对照组（0.086±0.014）和抗生素暴露组（0.064±0.016），降幅分别为29.5%和42.7%（p < 0.05）。此外，联合暴露组也显著低于高温暴露组（P < 0.05）。各生理指标的双因素方差分析结果详见表1。

在高温和达氟沙星暴露后第7天，测定了各组虫黄藻细胞的叶绿素a+c₂含量和F_v/F_m（图2），用以评估光合作用的变化。当不添加抗生素时，高温暴露组Cladocopium sp.的叶绿素含量（0.472±0.074 pg·cell⁻¹）相比于对照组（0.603±0.145 pg·cell⁻¹）显著减少了21.6%（P < 0.05），联合暴露组的叶绿素含量（0.406±0.114 pg·cell⁻¹）显著低于高温暴露组和抗生素暴露组（0.514±0.031 pg·cell⁻¹）（P< 0.05）。同样，联合暴露组Durusdinium sp.的叶绿素含量（0.416±0.050 pg·cell⁻¹）显著低于高温暴露组（0.538±0.042 pg·cell⁻¹）和抗生素暴露组（0.548±0.039 pg·cell⁻¹，P < 0.05），但高温暴露组与对照组（0.570±0.050 pg·cell⁻¹）之间未检测到显著差异（P> 0.05）。

Figure 2.  Comparison of chlorophyll content (A)and F_v/F_m (B)of Cladocopium sp. and Durusdinium sp. among different exposure groups

高温和达氟沙星暴露后Cladocopium sp. Fv/Fm的变化趋势同其叶绿素含量。高温暴露组（0.502±0.012）显著低于对照组（0.549±0.012），联合暴露组（0.486±0.011）显著低于高温暴露组和抗生素暴露组（0.514±0.031，P < 0.05）。与Cladocopium sp.不同，仅发现联合暴露组Durusdinium sp.的F_v/F_m（0.473±0.020）显著低于抗生素暴露组（0.494±0.028）（P < 0.05）。

在高温和达氟沙星暴露后第7天，检测了各组虫黄藻细胞的ROS含量，评估虫黄藻细胞的呼吸爆发水平（图3）。结果表明，Cladocopium sp.和Durusdinium sp.的变化趋势相同，即高温暴露组（Cladocopium sp.，1.820±0.228；Durusdinium sp.，1.349±0.151）显著高于对照组（Cladocopium sp.，1.000±0.178；Durusdinium sp.，1.000±0.122，P < 0.05）；联合暴露组（Cladocopium sp.，2.315±0.243；Durusdinium sp.，1.566±0.216）又显著高于高温暴露组和抗生素暴露组（Cladocopium sp.，1.312±0.258；Durusdinium sp.，1.290±0.238，P < 0.05）。

Figure 3.  Comparison of ROS levels of Cladocopium sp. and Durusdinium sp. among different exposure groups

在高温和达氟沙星暴露后第7天，测定了各组虫黄藻细胞的T-AOC和MDA含量，评估虫黄藻细胞的氧化应激水平（图4）。结果表明，Cladocopium sp.和Durusdinium sp.的T-AOC变化趋势一致。具体为：高温暴露组（Cladocopium sp.，0.165±0.033 μmol·mg⁻¹；Durusdinium sp.，0.231±0.076 μmol·mg⁻¹）显著高于对照组（Cladocopium sp.，0.108±0.036 μmol·mg⁻¹；Durusdinium sp.，0.144±0.081 μmol·mg⁻¹，P < 0.05），联合暴露组（Cladocopium sp.，0.240±0.060 μmol·mg⁻¹；Durusdinium sp.，0.411±0.088 μmol·mg⁻¹）又显著高于高温暴露组和抗生素暴露组（Cladocopium sp.，0.098±0.037 μmol·mg⁻¹；Durusdinium sp.，0.147±0.077 μmol·mg⁻¹，P< 0.05）。

Figure 4.  Comparison of T-AOC (A)and MDA (B)of Cladocopium sp. and Durusdinium sp. among different exposure groups

与T-AOC不同，Cladocopium sp.和Durusdinium sp.的MDA含量变化趋势存在明显差异。对于Cladocopium sp.，高温暴露组的MDA含量（12.263±2.993 nmol·mg⁻¹）相比于对照组（5.466±1.445 nmol·mg⁻¹）显著增加1.2倍（P < 0.05）。联合暴露组的MDA含量（15.19±1.553 nmol·mg⁻¹）相比于高温暴露组和抗生素暴露组（7.063±2.613 nmol·mg⁻¹）进一步显著增加（P < 0.05）。但是，对于Durusdinium sp.，仅发现联合暴露组的MDA含量（8.502±2.021 nmol·mg⁻¹）显著高于高温暴露组（6.206±1.209 nmol·mg⁻¹，P < 0.05）

在高温和达氟沙星暴露后第7天，测定各组虫黄藻细胞Caspase3的激活水平，以评估细胞凋亡情况（图5）。当不添加抗生素时，高温暴露组Cladocopium sp.的Caspase3激活水平相比于对照组显著上调70.27%（P < 0.05）。联合暴露组的Caspase3激活水平相比于高温暴露组和抗生素暴露组分别显著上调44.60%和99.47%（P < 0.05）。对于Durusdinium sp. Caspase3的激活水平，高温暴露组与对照组并没有显著差异（P > 0.05）。联合暴露组相比于高温暴露组和抗生素暴露组分别显著上调45.55%和52.18%（P< 0.05）。

Figure 5.  Comparison of Caspase3 activation levels of Cladocopium sp. and Durusdinium sp. among different exposure groups

作为与印度洋−太平洋区系造礁珊瑚共生的主要虫黄藻，Durusdinium属虫黄藻普遍被认为是耐热型的^[12]，而Cladocopium属虫黄藻则是热敏感型的^[14]。本研究通过比较热敏感型虫黄藻Cladocopium sp.与耐热型虫黄藻Durusdinium sp.在高温和达氟沙星联合暴露下的生理响应，系统地阐明了喹诺酮类抗生素暴露对两种虫黄藻耐热力的差异性影响机制。研究同步揭示了该类抗生素可通过损害共生虫黄藻的耐热力来调控珊瑚宿主的耐热力，并可能制约整个造礁珊瑚共生体对海洋热浪的生理适应能力。

高温暴露会对热敏感型Cladocopium属虫黄藻的光合系统PSⅡ反应中心造成不可逆损伤，产生的大量高能电子在叶绿体中与氧分子结合，生成超氧阴离子、过氧化氢等ROS分子^[27−28]。在本研究中，与对照组相比，高温暴露组Cladocopium sp.的ROS含量和T-AOC分别显著上升82.01%和52.81%，揭示细胞承受较高的氧化压力并诱导了抗氧化能力。然而，高温暴露组的MDA和Caspase3激活水平仍然出现显著上升，这是由于热敏感型虫黄藻的抗氧化系统难以有效清除过量的ROS，其能通过氧化光合膜脂、破坏D1蛋白的修复等途径造成细胞氧化凋亡^[27−30]。高温暴露后Cladocopium sp.的F_v/F_m、叶绿素含量和比生长速率分别显著下降8.54%、21.61%和42.13%，表明细胞产生了光合和生理损伤，进一步验证了Cladocopium sp.的热敏感性。

高温和达氟沙星联合暴露后，Cladocopium sp.的ROS、MDA含量、T-AOC和Caspase3激活水平均显著高于高温暴露组和抗生素暴露组，表明达氟沙星暴露加剧了细胞的氧化压力和凋亡，这可能是因为喹诺酮类抗生素能够通过阻碍藻细胞光合作用中的电子传递过程，诱导产生大量ROS，进而引起细胞氧化凋亡^[31−32]。联合暴露还降低了Cladocopium sp.的F_v/F_m、叶绿素含量和比生长速率。由此可见，达氟沙星暴露通过加剧细胞的氧化压力和凋亡，显著降低了热敏感型虫黄藻Cladocopium sp.的耐热力，并且这将进一步降低以其为主导虫黄藻属的珊瑚宿主的耐热力。

耐热型Durusdinium属虫黄藻能通过快速提升抗氧化能力和增强光合系统稳定性等多种机制有效应对高温带来的不利影响^{[13, 17]}。本研究结果表明，与对照组相比，高温暴露组Durusdinium sp.的ROS含量和T-AOC分别显著上升34.95%和60.44%，而MDA含量、Caspase3激活水平、F_v/F_m和叶绿素含量均没有显著变化。LaJeunesse等^[11]和Krueger等^[33]同样发现高温胁迫下Durusdinium属虫黄藻能够显著提升抗氧化能力，避免细胞氧化损伤和凋亡。高温暴露使Durusdinium sp.的比生长速率下降了29.49%，这可能是由于Durusdinium 属虫黄藻的抗氧化系统在高温下消耗了大量能量^[34]，而不是源于细胞凋亡。这些结果再次验证了Durusdinium sp.的光合耐热性。

高温和达氟沙星联合暴露后Durusdinium sp.的ROS含量、T-AOC和Caspase3激活水平相比于各单一暴露组显著增加，表明达氟沙星暴露同样加剧了胞内的氧化压力，诱导了抗氧化酶活性的上调，并进一步提升了细胞凋亡水平。联合暴露组的MDA含量仅显著高于高温暴露组，这表明达氟沙星暴露加剧了高温胁迫下Durusdinium sp.的膜脂过氧化。同时，联合暴露组的F_v/F_m仅显著低于抗生素暴露组，表明达氟沙星暴露没有明显影响高温胁迫下Durusdinium sp.的F_v/F_m。此外，联合暴露组的叶绿素含量和比生长速率相比于各单一暴露组均显著下降，揭示了Durusdinium sp.耐热力的降低。双因素方差分析进一步表明，高温和达氟沙星暴露对Durusdinium sp.叶绿素含量的降低具有显著的协同效应。由此可见，达氟沙星暴露降低了高温下Durusdinium sp.的光能捕获效率并导致细胞氧化和凋亡，削弱了其耐热力。同样，这也将削弱以Durusdinium为主导虫黄藻属的珊瑚宿主的耐热力。

虫黄藻Cladocopium sp.和Durusdinium sp.的ROS含量在高温暴露后均显著增加，并在联合暴露后达到峰值且显著高于各单一暴露组。联合暴露后两种虫黄藻的T-AOC、叶绿素含量和Caspase3激活水平均呈现类似ROS含量的变化。但是，两者的MDA含量、F_v/F_m和比生长速率变化存在明显的种间差异，表明达氟沙星暴露对两种虫黄藻的耐热力具有不同的影响方式。

相比于各单一暴露组，联合暴露组Cladocopium sp.的MDA含量均显著增加，F_v/F_m和叶绿素含量显著降低，表明达氟沙星暴露后产生的额外氧化压力与高温胁迫产生了叠加损伤效应。然而，联合暴露组Durusdinium sp.的MDA含量仅显著高于高温暴露组，F_v/F_m仅显著低于抗生素暴露组，这表明达氟沙星暴露加剧了高温胁迫下Durusdinium sp.的膜脂过氧化，但没有影响其光能转化效率。这印证了Durusdinium属虫黄藻的耐热力主要体现为能够有效保护光合系统并维持稳定的光合效率^[35]，这可能源于耐热型Durusdinium sp.的类囊体膜具有更高的双半乳糖基二酰甘油/单半乳糖基二酰甘油比例，这种膜脂特征有助于维持PSⅡ在胁迫下的结构稳定性^{[13, 36]}。同时，其高效的热激蛋白表达系统能够及时修复受损的D1蛋白等关键光合组分，从而在达氟沙星诱导的氧化压力下仍能保障光合核心功能的运转^{[15, 37]}。因此，尽管喹诺酮类抗生素能够靶向作用于叶绿体，造成氧化损伤和叶绿素含量的下降，但是并没有降低其F_v/F_m^[38−40]。此外，联合暴露组Cladocopium sp.的比生长速率仅显著低于抗生素暴露组，而Durusdinium sp.的比生长速率同时显著低于各单一暴露组，这可能是高温暴露对Cladocopium sp.比生长速率的负影响强于Durusdinium sp.所致。

研究揭示了达氟沙星暴露对两种典型珊瑚共生虫黄藻（热敏感型Cladocopium sp.与耐热型Durusdinium sp.）耐热力的影响。研究结果表明，达氟沙星暴露能降低两种虫黄藻的耐热力，但其抑制程度和机制存在差异。对于Cladocopium sp.，达氟沙星暴露与高温产生叠加损伤效应，全面加剧了细胞的光合和氧化损伤，诱导细胞凋亡，显著降低其耐热力；对于Durusdinium sp.，达氟沙星暴露没有显著影响其光合转化效率，仅是通过加剧细胞氧化和凋亡，从而削弱了其耐热力。这为深入评估全球变暖背景下抗生素污染对珊瑚礁生态系统的复合风险提供了理论依据和数据支撑。