Screening and identification of proteins interacting with CeWRI2 in Cyperus esculentus

本研究使用的油莎豆材料为‘热研3号’，样本取自中国热带农业科学院文昌试验基地（19°36′ N, 110°45′ E）。研究所用引物信息详见表1，所用载体为中国热带农业科学院热带生物技术研究所保存。

pGBKT7-CeWRI2构建 根据油莎豆基因组数据库信息设计CeWRI2基因克隆引物，以本实验室保存的1304-SubN-CeWRI2重组质粒为模板，将扩增产物纯化后通过Nimble Cloning技术连接到pGBKT7载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态，随后使用pGBKT7-CeWRI2-F、pGBKT7-CeWRI2-R引物（表1）对转化菌落进行PCR初筛，并对阳性克隆进行测序验证。

分别将pGBKT7空载质粒及pGBKT7-CeWRI2重组质粒转化至Y2H-Gold酵母感受态细胞中，涂布于SD/-Trp固体培养基上，28 ℃倒置培养2～3 d。随后分别挑取单克隆用无菌水稀释，将酵母菌液OD₆₀₀值调整至0.6，随后进行梯度稀释（1︰1、1︰10、1︰100、1︰1 000）。每个稀释度取10 μL点接于SD/-Trp固体培养基，28℃倒置培养2～3 d，最终观察并记录菌落生长状况。

将pGADT7空载质粒与pGBKT7-CeWRI2重组质粒共转化至Y2H-Gold酵母感受态中，均匀涂布于SD/-Trp-Leu培养基，28℃培养2～3 d。挑取单克隆菌落重悬于无菌水，经梯度稀释后，分别取10 μL菌液点接至以下培养基：SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade及含有不同浓度（5、10、15、20、25 mmol·L⁻¹）3-氨基-1,2,4-三氮唑（3-AT）的SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基。以共转化pGBKT7-p53与pGADT7-largeT作为阳性对照，共转化pGBKT7-laminC与pGADT7-largeT作为阴性对照。所有平板置于28℃培养2～3 d后，观察并记录酵母菌落生长状况。

利用PEG/LiAc法，将油莎豆pGADT7-cDNA文库转入含有诱饵质粒pGBKT7-CeWRI2感受态中，吸取20 μL培养物，经梯度稀释后，涂布于SD/-Trp-Leu平板，用于检测文库的转化效率。其余涂SD/-Trp-Leu-His+25 mmol·L⁻¹ 3AT+X-α-gal平板，每块200 μL，共40块。挑取培养基上生长良好的菌落提取酵母质粒，转化TOP10感受态细胞，PCR验证后，擎科生物公司测序，获得与CeWRI2互作蛋白的编码基因序列。

根据测序结果，在油莎豆本地数据库中进行BLAST比对，获取同源性最高的编码序列。设计上下游引物CeHB1-F/R，使用Takara（R045A）高保真酶Prime STAR^®Max DNA Polymerase，以cDNA为模板，扩增目标产物，通过1%（w）凝胶电泳检测PCR扩增产物，纯化回收后得到目的片段，构建pGADT7-CeHB1载体，转化DH5α大肠杆菌，擎科生物测序，确定获得候选的CeHB1基因序列。

对油莎豆候选基因CeHB1进行回转验证。将pGBKT7-CeWRI2诱饵质粒与pGADT7-CeHB1质粒共转到Y2H-Gold酵母感受态，涂布SD/-Trp-Leu培养基上，28℃培养2～3 d，挑取单克隆经浓度梯度稀释后点接SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade+25 mM 3AT固体培养基上，28℃倒置培养2～3 d，观察酵母生长情况。

提取油莎豆块茎、成熟叶、叶鞘、花、花茎、根、匍匐茎组织的总RNA，使用艾科瑞反转录试剂盒进行反转录，以CePDF2作为内参^[15]进行实时荧光定量PCR，每个样品设置3个生物学重复，采用2^−△△Ct法对目的基因进行相对表达分析。

用Duncan单因素方差分析不同组织基因表达数据间的差，用Prism8软件作图。

以本实验室保存的1304-SubN-CeWRI2重组质粒为模板，扩增CeWRI2基因的完整编码区（CDS）。经1%（w）琼脂糖凝胶电泳检测，可见一条大小约1 173 bp的单一明亮条带（图1-A），与CeWRI2基因预期长度一致。切胶回收该片段后，利用同源重组技术将其克隆至pGBKT7载体中。转化后通过菌落PCR筛选阳性克隆（图1-B），经测序验证正确后提取质粒，获得pGBKT7-CeWRI2诱饵载体，供后续实验使用。

Figure 1.  Construction of the pGBKT7-CeWRI2 bait expression vector

为了确保诱饵蛋白CeWRI2在酵母细胞中表达后不影响后续酵母双杂交筛选，分别将成功构建的pGBKT7-CeWRI2诱饵载体与空载pGBKT7转化至Y2H-Gold酵母感受态细胞中。对比结果显示，2种质粒转化后的酵母菌落生长状态未见明显差异（图2），说明CeWRI2未对酵母细胞的正常生长产生毒性影响，所构建的载体可用于酵母双杂交，筛选与其互作的蛋白。

Figure 2.  Toxicity detection of pGBKT7-CeWRI2

为了避免诱饵蛋白CeWRI2自激活造成酵母双杂交筛选出现假阳性结果，将pGBKT7-CeWRI2与空载pGADT7共转化至Y2H-Gold酵母菌株。结果由图3显示，在SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培养基上，阳性对照（pGADT7-largeT+pGBKT7-p53）与实验组（pGADT7+pGBKT7-CeWRI2）均可正常生长，而阴性对照（pGADT7-largeT+pGBKT7-lamC）则无法生长，表明CeWRI2本身具有转录自激活能力。进一步实验发现，在培养基中添加25 mmol·L^-1

Figure 3.  Self-activation detection of pGBKT7-CeWRI2

3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）可有效抑制该自激活现象；后续酵母双杂交实验均添加25 mmol·L⁻¹的3-AT。

将含有pGBKT7-CeWRI2的Y2H-Gold酵母菌液培养至0D₆₀₀=0.6，制备感受态，利用本课题组保存的油莎豆pGADT7-cDNA文库质粒，对CeWRI2的互作蛋白进行筛选。转化效率通过涂布SD/-TL平板检测。每100 μL转化混合物获得约461个克隆，1/10稀释在SD/-TL/X-α-gal平板上长出59个克隆，1︰100稀释长出7个克隆（图4-A）。最终在SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷型培养基上获得49个阳性酵母克隆（图4-B）。提取阳性酵母菌质粒，转入TOP10酵母感受态，用pGADT7的载体引物进行菌落PCR检测并测序，测序结果通过NCBI网站以及油莎豆本地BLAST序列比对共筛选出能进行功能注释的17个候选蛋白信息（表2）。这17个蛋白中仅有2个为转录因子分别属于HD-ZIP和VOZ家族，其同源蛋白在植物生长发育和逆境胁迫响应等过程起重要作用；其余15个则为功能蛋白，功能蛋白又分为9种分子功能，包括信号转导与激酶活性、物质转运、蛋白质稳态、代谢与能量调控、核酸稳态、细胞结构与抗氧化以及底物识别与结构域蛋白。基于CeWRI2的筛库结果，选择编号1的候选蛋白同源异形盒−亮氨酸拉链蛋白HOX16-like开展后续功能研究，该蛋白属于HD-ZIP转录因子家族中的HD-ZIP I亚家族，包含1个高度保守的HD结构域^[16]。前期研究表明，HD-ZIP蛋白主要通过脱落酸（ABA）介导的信号转导途径调节下游逆境相关基因的表达，并通过调节植物的生长发育来调节植物的抗逆性^[17]。由于ABA在油脂调控中的作用，因此推测该蛋白可能与“碳−氮再分配”相关。

Figure 4.  Screening for Proteins Interacting with pGBKT7-CeWRI2

为进一步验证候选蛋白CeHB1与CeWRI2蛋白的互作关系，进行酵母双杂交点对点验证。在油莎豆本地数据库中获取CeHB1编码序列，设计特异性引物，CeHB1-F/R（表1），以油莎豆块茎cDNA为模板克隆CeHB1基因，构建pGADT7-CeHB1重组质粒。阳性克隆测序验证后（图5），与pGBKT7-CeWRI2诱饵载体共转到Y2H-Gold酵母菌株。转化后在SD/-Trp-Leu+X-α-gal培养基上均能生长，说明pGADT7-CeHB1和pGBKT7-CeWRI2已转化酵母并表达。挑取单克隆点于SD/-Trp-Leu-His-Ade+25 mM 3AT固体培养基上培养，除阴性对照外，所有的实验组均能正常生长，表明CeWRI2与CeHB1存在蛋白互作关系（图6）。

Figure 5.  PCR verification of Tiger Nut CeHB1 protein gene cloned from Escherichia coli

Figure 6.  Yeast two-hybrid one-to-one validation of the interaction between CeWRI2 and CeHB1 proteins

为了揭示CeHB1基因的表达特性，通过实时荧光定量分析了CeHB1在油莎豆叶片、叶鞘、花、花茎、匍匐茎、根和块茎这7个主要组织中的表达模式（图7）。结果表明，CeHB1在油莎豆块茎中的表达丰度最高，其次是花茎，在其余组织中表达水平显著降低（图7-B）。结果表明，CeWRI2（图7-A）与CeHB1的表达模式具有高度相似性，两者均在块茎中表达量最高，表现出明显的协同表达趋势。这说明CeHB1有可能通过调控油莎豆块茎的生长发育或油脂合成相关基因的表达，参与油莎豆中的油脂积累。

Figure 7.  Expression analysis of the CeHB1 in different organ of tigernut

WRI2属于AP2/ERF转录因子超家族中的AP2亚族（APETALA2-like group），其特征为含有1～2个约60～70个氨基酸的AP2/ERF DNA结合结构域。在拟南芥中，WRI2与WRI1、WRI3、WRI4共同构成WRI1-like亚组（亦称ANT类群），在调控脂肪酸从头合成及碳源分配中发挥重要的作用。在拟南芥中，存在3个成员，AtWRI1、AtWRI2和AtWRI3/4。其中，AtWRI2不能互补atwri1-1的功能，被认为无法参与油脂的代谢调控^[38]。但在牛油果中，PaWRI2具有转录激活功能，并且已经证实WRI2在牛油果中参与油脂的调控^[11]。课题组前期研究发现，油莎豆块茎中克隆的WRI1旁系同源基因CeWRI2与牛油果PaWRI2具有相似的理化性质。随着块茎发育，CeWRI2的表达量逐渐上升，且与油脂积累趋势呈正相关，提示其可能参与油脂代谢调控。进一步实验表明，CeWRI2定位于细胞核，并具有转录激活活性。该基因能够互补拟南芥wri1-1突变体表型，且在烟草叶片中瞬时过表达可显著提高油脂含量^[13]。推测CeWRI2可能通过与其他转录因子相互作用，调控脂肪酸（Fatty acids，FA）合成和TAG合成相关基因的表达，从而在油莎豆油脂合成中可能发挥重要作用。

本研究通过酵母双杂交技术，筛选与油莎豆转录因子CeWRI2的互作蛋白，成功获得17个候选互作蛋白，为解析其调控块茎油脂积累的分子机制提供了关键线索。17个候选蛋白中，有2个为转录调控因子，分别属于Homeobox-ZIP（HD-ZIP）转录因子家族和VOZ（Vascular plant One-Zinc finger）转录因子家族；HD-Zip I亚家族成员通常响应ABA等逆境信号，调控生长发育^[17]；拟南芥中的AtVOZ1蛋白和AtVOZ2蛋白均已被证明是作为转录因子发挥功能^[39]，且能够促进拟南芥开花^[40]；但在调控开花途径中具有功能冗余，并可以降低拟南芥对非生物胁迫的抗性，增加其对生物胁迫的抗性^[20,41]。获得的15个功能蛋白，这些蛋白广泛参与糖与能量代谢、蛋白质稳态、信号转导及细胞结构维持等过程，暗示CeWRI2可能作为“代谢协调枢纽”，通过多维互作网络调控油脂合成。

基于上述筛选，本研究进一步聚焦于HD-ZIP家族成员CeHB1，尽管目前尚无直接证据表明CeHB1本身参与油脂合成，但有研究表明，在拟南芥中响应ABA与干旱胁迫的转录因子MYB96，被证实能直接激活油脂合成关键基因（如DGAT1和PDAT1），从而诱导营养组织中的三酰甘油积累^[42]；ABA信号通路的核心转录因子ABI4，也被证明可直接结合并激活油脂合成限速酶基因DGAT1的启动子，从而影响种子油脂积累^[43]。本研究通过酵母双杂交实验，初步确认其与CeWRI2存在互作。组织特异性表达分析显示，CeHB1在油莎豆不同组织中的表达具有明显差异，其在块茎中的转录水平显著高于其他组织。块茎是油莎豆储存油脂和淀粉的主要库器官，因此，CeHB1的高表达暗示其潜在角色与“库强度”建立或发育有关。然而，本结果仅反映静态表达差异，后续应结合块茎发育不同时期以及基因功能丧失实验，进一步验证CeHB1是否确为调控油莎豆块茎油脂积累的关键因子。本研究仅是初步结果，后续将利用荧光素酶互补实验（Luciferase Complementation Assay，LCA）、双分子荧光互补实验（Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC）等技术在植物体内验证互作，并进一步探究互作对CeWRI2转录活性、蛋白稳定性及亚细胞定位的影响。未来工作应结合转录组、代谢组与ChIP-seq等多组学技术，动态解析CeWRI2及其互作因子调控的下游网络，从而系统地阐明油莎豆块茎高效积累油脂的分子机制，为油莎豆开发利用奠定坚实的理论基础。