Cloning and functional analysis of the tobacco potassium transporter NtKUP6 Gene

以豫中烟区主栽品种中烟100（Nicotiana tabacum L.）为研究对象。植株于2024年种植在国家烟草基因研究中心的人工气候室，采集旺长期烟株的根、茎、叶和盛花期烟株的花等组织器官，经液氮速冻后，−80℃冰箱保存备用。每个组织至少3个生物学重复。亚细胞定位、瞬时沉默及过表达实验的材料均为本氏烟草。培养条件：温度（26±1）℃，相对湿度60%，16 h光照培养，8 h黑暗培养。

中烟100种子消毒后点在1/2 MS固体培养基上，萌发生长2周后选取生长良好且长势相同的幼苗进行非生物胁迫处理。选取175 mmol·L⁻¹ NaCl、200 mmol·L⁻¹甘露醇和4℃分别进行盐、干旱和冷胁迫处理。取样时间为0 、1 、3 、12 、24 、48 和96 h，取样部位为全部整株幼苗，每个处理均设置3个生物学重复，液氮冷冻后置于-80℃超低温冰箱保存。

使用Polysaccharide/polyphenol Plant Total RNA Mini Kit（GeneBetter）试剂盒提取烟草中烟100根部总RNA。使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche）试剂盒反转录获得cDNA用于克隆NtKUP6基因。使用Primer Premier 5.0软件设计NtKUP6基因的扩增引物（表1）。50 μL的基因扩增体系包含cDNA 1 μL、上下游引物各1 μL、dNTP Mixture 6 μL、5×PrimerSTAR GXL Buffer 10 μL、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 μL及ddH₂O 30 μL。PCR反应程序为98℃变性10 s，55℃退火15 s，68℃延伸30 s，35个循环。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，将胶回收纯化的PCR产物连接至pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态。经PCR验证的阳性克隆菌送北京六合华大基因科技有限公司测序。

利用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）对NtKUP6蛋白进行理化性质分析。利用TMHMM-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）对NtKUP6蛋白进行跨膜结构预测。利用Plant-mPLoc在线工具 （http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）对NtKUP6蛋白进行亚细胞定位预测。利用NetPhos-3.1（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）对NtKUP6蛋白进行磷酸化位点预测。利用SOPMA（https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）对NtKUP6蛋白进行二级结构预测。利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）对NtKUP6蛋白进行三级结构预测。利用PlantCARE（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对NtKUP6基因的上游2000 bp启动子区进行顺式作用元件分析。

将NtKUP6基因克隆至pC1300s-35S-GFP载体上构建重组表达载体pC1300s-35S-NtKUP6-GFP，转化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株，注射本氏烟草，暗光培养48 h后使用激光共聚焦显微镜观察GFP荧光信号。

选取旺长期的根、茎、叶和盛花期的花等4种不同组织的样品，液氮速冻后-80℃保存。提取不同组织样品的RNA，反转录为cDNA，以此为模板进行NtKUP6基因在各组织的表达分析。另提取保存的非生物胁迫处理样品的RNA，反转录cDNA后，以此为模板进行NtKUP6基因在非生物胁迫下的表达分析。以Nt26S为内参基因，用Primer Premier 5.0软件设计引物（表1），进行实时荧光定量PCR。反应体系按照罗氏的FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）预混液说明书配制。反应程序：94℃预变性30 s；94℃变性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，45个循环。每个样品设置3个重复，使用的荧光定量PCR仪型号是Roche LightCycler 96，运用2^-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。

根据NtKUP6基因序列设计特异性引物NtKUP6-VIGS-F/ NtKUP6-VIGS-R（表1），以根部cDNA为模板，通过PCR扩增得到目的片段。将目的片段连接到pTRV2载体上，转化大肠杆菌DH5α，测序获得阳性克隆TRV2-NtKUP6后，提取质粒转化GV3101农杆菌感受态。

瞬时沉默方法参考文献[25]，选取叶片大小一致的本氏烟，将菌液注满展平的叶片，注射后的烟苗黑暗培养过夜后恢复至正常光照培养。注射一周左右pTRV2-PDS（阳性对照）的烟苗出现白化表型，注射两周左右选取长势较好的6株新生叶片，液氮速冻后，−80℃保存备用，后续进行NtKUP6基因的定量分析及钾离子含量测定。

利用引物NtKUP6-F/NtKUP6-R（表1）将NtKUP6基因克隆至表达载体pDT1上，测序获得正确的pDT1-NtKUP6重组质粒，转化GV3101农杆菌感受态。将注射菌液于室温避光静置3～5 h，注射本氏烟，空载体菌株为对照。注射后的烟苗黑暗培养过夜后恢复至正常光照培养，注射后72 h采集长势较好的注射叶片每种6株，进行后续基因表达检测和钾离子含量测定。

将保存的VIGS植株及过表达叶片样品冷冻干燥后，使用混合型振荡研磨仪研磨至粉末状，称取约0.0500 g（精确至0.1 mg）粉末，置于10 mL 5%（体积分数）醋酸中，30 ℃震荡萃取30 min，然后用定性滤纸过滤，滤液经稀释后用美国安莱立思Alalis MP6500型台式pH计测定钾离子含量。

本研究所有试验均设置至少3个生物学重复，试验原始数据利用Excel进行整理，然后使用Graph Pad Prim 8.0软件进行图表绘制，所有实验结果均以平均值±标准差（Mean±SD）表示。对两个独立样本的比较采用独立样本t检验分析组间差异显著性，对多组样本比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）结合Duncan氏多重比较法分析组间差异。

以烟草中烟100根部cDNA为模板，经PCR扩增，PCR产物的琼脂糖电泳检测结果如图1所示，获得了一条大小约2500bp的DNA片段。目的片段回收后测序，分析发现该段序列包含一个完整的开放阅读框（ORF），全长2355 bp，编码784个氨基酸。使用Clustal W将NtKUP6与NCBI中下载拟南芥KUP6亚家族蛋白进行比对分析，发现NtKUP6具有KUP/HAK/KT家族的保守区域GXXXGDXXXSPLY和KQXXALGCFPKXKIVHTSXKXXGQIYIPENWILM ^[26]（图2）。

Figure 1.  Electropherogram of the full-length sequence of NtKUP6 gene in Nicotiana tabacum

Figure 2.  Alignment of amino acid sequence of NtKUP6 and KUP6 subfamily members in Arabidopsis thaliana

使用在线分析工具ProtParam对NtKUP6蛋白序列进行分析，该蛋白相对分子质量为87.9 kDa，理论等电点为8.76，不稳定系数为37.48，说明该蛋白属于稳定蛋白。NtKUP6蛋白包含了20种氨基酸，含量最高的是亮氨酸（11.2%），含量最低的是色氨酸（1.4%）。脂肪族氨基酸指数为107.86，具有高脂肪族性质。利用TMHMM-2.0对NtKUP6蛋白进行跨膜结构分析，结果显示，该蛋白共有11个跨膜结构域（图3-A），其中第2、3跨膜区之间存在1个胞质环（Loop）结构，C端具有较长的胞外区。利用Plant-mPLoc预测NtKUP6蛋白的亚细胞定位于细胞膜、液泡。利用NetPhos-3.1对NtKUP6蛋白进行磷酸化位点预测，共发现44个丝氨酸、23个苏氨酸和7个酪氨酸位点（图3-B）。二级结构分析显示，α-螺旋（40.82%，320个氨基酸）和无规则卷曲（41.71%，327个氨基酸）是构成NtKUP6蛋白的主要结构元件，延伸链（17.47%，137个氨基酸）则分散在整个蛋白中（图3-C）。进一步三级结构预测以V4VGN3.1.A柑橘（Citrus clementina）钾离子通道蛋白三级结构（AlphaFold DB model）为参考模型，相似度为82.63%，GMQE值为0.77，蛋白含有丰富的无规则卷曲和α-螺旋（图3-D），与二级结构预测结果一致。

Figure 3.  Bioinformatics analysis of the NtKUP6 protein in tobacco

顺式作用元件分析结果如表2所示，NtKUP6基因启动子区含有干旱响应的MBS元件和防御应激响应的TC-rich repeats元件， ABA响应的ABRE元件和GA响应的P-box元件，以及参与光响应的AT1基序等作用元件。

为明确NtKUP6蛋白的亚细胞定位，本研究构建了NtKUP6-GFP融合表达载体，转化农杆菌后注射本氏烟叶片，以细胞膜mCherry为marker，通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光信号，结果如图4所示，NtKUP6-GFP融合蛋白在细胞边缘呈现清晰的环状绿色荧光信号，与膜蛋白marker蛋白mCherry的红色荧光信号叠加后呈现黄色荧光，表明NtKUP6蛋白定位于细胞膜。

Figure 4.  Subcellular localization of NtKUP6 protein

对NtKUP6基因在烟草根、茎、叶、花等组织器官的表达进行了qRT-PCR分析，结果如图5所示，NtKUP6基因在不同组织器官均有表达，且根部相对表达量最高。

Figure 5.  Tissue expression analysis of NtKUP6 gene

启动子分析表明，NtKUP6基因启动子含有干旱等胁迫响应元件及脱落酸（Abscisic Acid, ABA）等激素响应元件，提示该基因可能参与干旱等非生物胁迫应答及ABA信号调控。为验证这一可能性，利用qRT-PCR检测了NtKUP6基因在干旱、盐、低温及ABA处理下的表达情况，结果如图6所示。在干旱胁迫处理下，NtKUP6基因表达显著升高，在处理12 ～24 h维持较高水平后，随着处理时间的增加NtKUP6基因的表达量又迅速下降；在盐胁迫处理下，NtKUP6基因表达量显著升高，处理3 h表达量达到最高；冷胁迫处理下，随着处理时间的增加，NtKUP6基因表达量一直维持在较高水平；在ABA处理下，NtKUP6基因表达量与干旱处理类似，经历一个先升高再降低的过程。总之，NtKUP6基因对各种非生物胁迫及ABA处理均有响应。

Figure 6.  Expression analysis of the NtKUP6 gene under abiotic stress and ABA treatment

为了进一步明确NtKUP6基因的功能，构建了NtKUP6基因的VIGS瞬时沉默载体，转化农杆菌后注射本氏烟，生长10 d左右取新长出的叶片检测沉默效率并测定叶片钾离子含量，结果表明，相对于pTRV2，pTRV2:NtKUP6沉默植株中NtKUP6基因的表达量降低了69%（图7-A），且沉默植株叶片钾离子含量降低了39.3%（图7-B）。

Figure 7.  Determination of K⁺ contents in NtKUP6 gene VIGS silenced plants

对NtKUP6基因在本氏烟中过表达，分别在本氏烟注射后72 h采样注射叶片，对采集的叶片进行基因表达检测和钾离子含量测定，结果如图7所示。与对照相比，过表达植株叶片中NtKUP6基因的表达量升高了近160倍（图8-A），且过表达植株叶片钾离子含量升高了约53%（图8-B）。

Figure 8.  Determination of K⁺ contents in NtKUP6 gene overexpression plants

钾离子转运蛋白在植物维持K⁺稳态和应对非生物胁迫过程中发挥着核心作用^[15]。其中，KUP/HAK/KT家族是负责高亲和性吸收的关键成员。本研究从烟草中烟100中成功克隆了NtKUP6基因，并对其功能进行了初步探索。序列分析结果表明，NtKUP6蛋白具有KUP/HAK/KT家族的典型保守结构域，并与拟南芥KUP6亚家族成员高度同源^[27]，说明NtKUP6在进化上的保守性和功能上的相似性。生物信息学分析结果表明，NtKUP6是一个稳定的疏水性蛋白，具有11个预测的跨膜结构域，这与NtKUP6作为膜定位转运蛋白的功能定位相符。进一步的亚细胞定位结果预测了NtKUP6可能定位于细胞膜、液泡膜，说明该蛋白不仅负责从外界吸收K⁺，也可能参与细胞内K⁺的区隔化储存。这个暗示在离子稳态调节中具有重要意义。

组织表达模式分析结果表明，NtKUP6基因在烟草根部的相对表达量最高，且在茎、叶、花等组织中均有一定表达（图4），这与其他物种中多数KUP/HAT/KT家族成员的表达模式相似^[7,10]，体现了该家族基因功能的进化保守性。烟草根系是钾离子吸收的主要器官，NtKUP6在根中高表达的特性，与NtKUP6作为HAK/KUP/KT家族成员参与根部高亲和钾吸收的功能定位一致，这说明NtKUP6基因是烟草从土壤中获取K⁺的核心转运蛋白。而NtKUP6基因在地上部组织的广泛表达，推测NtKUP6可能同时参与K⁺在植物体内的长距离运输及不同组织中的分配，为叶片等经济器官的钾积累提供保障。

多项研究表明HAK/KUP/KT蛋白与非生物胁迫有关^[5]。如拟南芥kup268突变体对干旱胁迫敏感，且KUP6受到ABA信号通路的直接调控，通过平衡K⁺稳态实现渗透调节进而抵御干旱胁迫^[28]。在水稻中过表达OsHAK5能够增加烟草BY2细胞中的K⁺积累并增强耐盐性^[29]。对NtKUP6基因启动子区进行分析发现，含有干旱响应的MBS元件、ABA响应的ABRE元件以及防御与应激相关的TC-rich repeats等多种顺式作用元件（表2），这为NtKUP6基因该基因响应非生物胁迫及激素信号提供了分子基础。随后的qRT-PCR实验结果证实了这一推测，NtKUP6基因对干旱、盐、冷及外源ABA处理均呈现显著的响应特征，但不同胁迫下的表达模式存在明显差异。在干旱与ABA处理下，NtKUP6基因表达呈“先升后降“趋势，推测NtKUP6基因在胁迫早期通过快速上调表达增强钾吸收与稳态维持，以提升细胞渗透压、减少水分流失，而后期表达下调可能是植物通过反馈调节避免钾过量积累造成的代谢负担，且ABA响应元件ABRE的存在说明NtKUP6基因可能通过ABA信号通路介导干旱胁迫的适应性反应。在盐胁迫下，NtKUP6基因在处理3 h表达量达到峰值，后续逐渐下降，这一快速响应特征可能与短期盐胁迫下植物快速积累K⁺以平衡Na⁺毒性、维持细胞膜稳定性相关，体现了NtKUP6基因在盐胁迫早期离子平衡调节中的关键作用。在冷胁迫下，NtKUP6基因表达持续维持高水平，推测K⁺作为渗透调节物质和酶活性保护剂，NtKUP6的持续高表达可通过稳定细胞内钾浓度，减轻低温对细胞膜结构和代谢酶活性的损伤，这与冷胁迫下植物对钾稳态的长期需求相符，也为烟草低温逆境适应性提供了新的调控线索。

为了验证NtKUP6在烟草K⁺积累中的功能，通过VIGS技术获得瞬时沉默植株，结果显示沉默植株NtKUP6的表达量降低69%，叶片中K⁺含量也随之下降39.3%；而本氏烟中过表达NtKUP6后，基因表达量升高近160倍，叶片K⁺含量显著提升约53%。这一结果与水稻OsHAK16的功能类似^[30]，证明NtKUP6基因对于烟草叶片中的K⁺积累具有关键调控的作用。结合NtKUP6基因的组织表达与胁迫响应特征，基因瞬时沉默后叶片K⁺含量的显著降低，可能与根系钾吸收能力下降或体内K⁺转运受阻有关。根中高表达保障基础钾吸收，胁迫诱导表达强化逆境下的钾稳态调节，最终通过调控钾积累实现对烟草生长发育及抗逆性的支撑。

当然，本研究仍存在一定局限性，NtKUP6在木质部装载或韧皮部再转运中的具体作用尚未明确，NtKUP6与其他钾转运蛋白的协同调控机制也有待探究。未来通过CRISPR或过表达等方法获得稳定遗传突变体，可更全面地评估该基因在烟草整个生育期中对钾吸收、分配及抗逆性的综合影响；同时结合转录组测序、酵母双杂交、非损伤微测（NMT）等技术，进一步解析NtKUP6参与的调控通路及互作蛋白，为深入阐明烟草钾营养与抗逆协同调控的分子机制提供更充分的依据。