Identification of modified nucleosides in tRNA of Acetobacter pasteurianus and the characteristics of response to acid stress

无水乙醇、葡萄糖购买自西陇科学股份有限公司；蛋白胨和酵母提取物购买自英国Oxoid公司；甲酰胺、EDTA、丙烯腈、三甲胺购买自上海麦克林生化科技股份有限公司；SDS购买自北京索莱宝科技有限公司；1-溴-3氯丙烷购买自上海迈瑞尔化学技术有限公司；碱性磷酸酶购买自北京宝日医生物技术有限公司；RNase T₁ 和RNase A购买自赛默飞世尔科技公司；核酸酶P₁购买自北京纽英伦生物技术有限公司；蛇毒磷酸二酯酶购买自上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；甲醇、乙腈等流动相成分购买自德国默克公司。

巴氏醋杆菌AS 1.41（Acetobacter pasteurianus AS 1.41）购买自湖南丰晖生物科技有限公司。菌株培养使用GYP培养基（葡萄糖2%，酵母提取物0.5%，蛋白胨0.5%，乙醇3%），在此基础上分别设置0%、1%、2%（V/V）乙酸胁迫组，每个胁迫组别设置3个重复，170 r·min^-1，30℃培养96 h。

修饰核苷鉴定使用Thermo Scientific Orbitrap Exploris 120 质谱仪；核苷分析使用SCIEX Triple Quad 7500质谱仪；寡核苷酸分析使用Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480质谱仪；各型质谱仪均联用高效液相色谱仪。

采用甲酰胺—苯酚法提取巴氏醋杆菌总RNA。菌株培养96 h后，7 000 r·min⁻¹ 离心5 min收集菌体，加入10%发酵液体积的甲酰胺抽提剂（EDTA 18 mmol·L⁻¹，SDS 0.025%，β−巯基乙醇1%，甲酰胺定容至对应体积），涡旋混匀，95℃水浴振荡5 min，然后9 000 r·min⁻¹ 离心10 min取上清液，分别加入等体积的水饱和苯酚和1−溴−3氯丙烷，振荡混匀，9 000 r·min⁻¹离心10 min取上清液，经乙醇沉淀回收获得总RNA，再经10%尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳实现成分分离，切胶回收总tRNA。

将10 μg tRNA溶解于3 μL水中，加入30 μL 41%（V/V）乙醇/三甲胺乙酸盐和10 μL丙烯腈，72℃孵育2 h，乙醇沉淀回收^[26]。

核苷分析：使用0.1 U核酸酶P₁，在pH5.3环境下37℃消化1 h，然后使用500 mmol·L⁻¹ Tris-HCl调整pH至9.0，加入5 U碱性磷酸酶和0.5 U蛇毒磷酸二酯酶，37℃酶切1 h，真空干燥。寡核苷酸分析：使用20 U的RNase T₁和20 ng的RNase A在37℃消化1 h，缓冲液分别为0.25 mol·L⁻¹ 乙酸铵（pH 5.3）和0.25 mol·L⁻¹ 乙酸铵（pH 7.0）。

核苷分析采用电喷雾电离正离子模式，流动相A为0.1%（V/V）甲酸水，流动相B为0.1%（V/V）甲酸95%（V/V）乙腈水，采用Waters Acquity UPLC BEH amide色谱柱（2.1 mm×150 mm, 1.7 μm）在36℃条件下分离，流速为100 μL·min⁻¹，梯度洗脱程序为：0～5 min，90% B相；5～35 min，由90% B相线性降至40% B相；35～40 min，维持40% B相。寡核苷酸分析采用电喷雾电离负离子模式，消化产物等体积混合0.1 mol·L^-1三乙胺醋酸盐缓冲液（pH 7.0），流动相A为水，流动相B为乙腈。两相均含有1.0%（V/V）的六氟异丙醇和0.24%（V/V）的三乙胺，色谱柱为Oligonucleotide BEH C18柱（2.1 mm×100 mm, 1.7 μm），色谱分离条件参照此前报导的方法设置^[27]。

tRNA修饰的类型、分子结构、分子质量、离子对、修饰酶的蛋白序列等信息来自Modomics数据库（https://genesilico.pl/modomics/）^[1]和Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）。Blastp工具来自NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。质谱数据使用Thermo Xcalibur Qual Browser和SCIEX OS软件进行分析。

通过尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总tRNA和其他RNA组分，切胶回收后，经尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳验证。电泳图显示，巴氏醋杆菌总tRNA成分完整，无降解，可以用作后续分析（图1）。

采用三重四极杆质谱和高分辨质谱对从巴氏醋杆菌tRNA上消化下来的修饰核苷进行鉴定和相对定量追踪。如图2-A所示，336→136和336→204离子对可用于检测修饰核苷i⁶A（N⁶-isopentenyladenosine）。m/z 136和204的产物离子分别对应i⁶A裂解得到的腺苷碎片及异戊烯基修饰腺苷碎片（图2-B）。同时可以在高分辨质谱上得到i⁶A正电离子（z=+1）的精确质荷比336.1664（与理论值336.1672质量差为-0.0008 Da）。二级谱显示对应清晰的136和204产物离子（图2-C）。通过这样的方法在质谱上检测出14种tRNA修饰核苷，包括κ²C（2-lysidine）, ms²i⁶A（2-methylthio-N⁶-isopentenyladenosine）, i⁶A（N⁶-isopentenyladenosine）, Ψ（pseudouridine）, D（dihydrouridine）, Am（2'-O-methyladenosine）, m²A（2-methyladenosine）, m¹A（1-methyladenosine）, ms²t⁶A（2-methylthio-N⁶-threonylcarbamoyladenosine）, t⁶A（N⁶-threonylcarbamoyladenosine）, Cm（2'-O-methylcytidine）, m¹G（1-methylguanosine）, m⁷G（7-methylguanosine）以及Q（queuosine），同分异构体通过保留时间区分，各修饰核苷的提取离子色谱峰如图3所示。

Figure 2.  Schematic illustration of modified nucleoside identification

tRNA修饰所在的位点与它的功能密切相关。例如前面提到的Inosine在tRNA 第34位上参与wobble摆动拓宽了tRNA解读密码子的范围。将巴氏醋杆菌的总tRNA进行限制性核苷酸酶T₁和限制性核苷酸酶A的消化，可以通过寡核苷酸分析定位tRNA修饰的具体位点。以巴氏醋杆菌tRNA^Pro-UGG为例，该tRNA经RNase T₁消化切割后产生特征片段U[Um]UUGp，位于反密码子环，且携带一个甲基化修饰（图4-A）。通过观察该片段的一级精确质荷比（图4-B）和对碰撞诱导碎裂的特定产物离子的鉴定，得到其中的修饰Um的位置（图4-C）。在这里仅采用具有序列独特性的片段进行鉴定，即某片段的序列在巴氏醋杆菌所有tRNA中仅能在特定某一个tRNA上找到时，才认为其中的修饰位点是可信的。通过寡核苷酸分析方法，在核苷分析鉴定的14种tRNA修饰的基础上还鉴定出了Um，cmnm⁵Um，mnm⁵U，cmnm⁵U，cmnm⁵s²U五种修饰。这五种修饰都是正电模式下难以电离的尿苷衍生物，在负电模式的寡核苷酸分析中得以检出。序列独特性片段及修饰位点的汇总结果如表1所示。

Figure 4.  Schematic diagram of oligonucleotide analysis and modified nucleoside localization

假尿苷（$ \Psi $）与尿苷（U）互为同分异构体，分子质量相同，因此难以在常规质谱分析中仅凭质量差异直接区分与鉴定$ \Psi $。为解决这一问题，本研究采用氰乙基化衍生化策略，使$\Psi $的N1位发生加成反应，生成人工衍生物“$\Psi $-CE”。寡核苷酸片段中每引入一个$\Psi $-CE位点，其分子质量将增加53Da，从而可在二级质谱（MS/MS）中实现$ \Psi$位点的判定。基于“化学加成—质谱检测”的方法，在巴氏醋杆菌总tRNA中共鉴定到7个$\Psi $位点，分别位于第31、32、38、39、40、55和70位，汇总见表2 。

通过在巴氏醋杆菌蛋白组中检索并比对已报道的大肠杆菌/枯草芽孢杆菌tRNA修饰酶同源蛋白发现，尽管本研究的质谱数据尚未检出或定位到D16/17、gluQ34（glutamyl-queuosine）以及ho⁵U34（5-hydroxyuridine）等修饰，但巴氏醋杆菌基因组/蛋白组中存在对应的同源修饰酶DusB、GluQRS和TrhO。鉴于LC–MS检测存在一定检出限，同时细菌可能在不同生长条件下动态调节tRNA修饰丰度，综合酶学同源性证据与技术因素，初步推测巴氏醋杆菌中D16/17、I34、gluQ34及ho⁵U34等修饰具有潜在存在的可能。

综合核苷分析、寡核苷酸分析及同源比对结果，初步绘制了巴氏醋杆菌的tRNA修饰图谱（图5），系统呈现了21种修饰核苷的类型及其在tRNA上的位点分布特征。与多数真细菌一致，巴氏醋杆菌tRNA反密码子环上第34位和第37位包含的修饰类型最丰富，该区域修饰已被证明与翻译效率、翻译保真性和tRNA氨基酸酰化密切相关^[28-29]。此外，巴氏醋杆菌在tRNA第31、32、38、39和40位存在相对密集的假尿苷（Ψ）分布，并在第46位检测到m⁷G修饰。

Figure 5.  Landscape of tRNA modifications in Acetobacter

巴氏醋杆菌耐酸性能突出，即使在2%乙酸环境下仍可维持代谢活性与生长。尿苷（U）是RNA分子中的基础核苷之一，含量相对稳定，且在质谱分析中信号响应可靠，其峰面积可在一定程度上反映RNA总量，因此常被用作修饰核苷相对定量的归一化参照^[30-31]。基于此，本研究采用三重四极杆质谱追踪1%与2%乙酸胁迫条件下巴氏醋杆菌tRNA中t⁶A、m⁷G、ms²i⁶A、κ²C、i⁶A、m²A、Cm、D、m¹G及Ψ等修饰的信号强度，并以尿苷峰面积进行归一化处理，绘制获得tRNA修饰动态变化热图（图6）。热图结果显示，乙酸胁迫下κ²C水平呈剂量依赖性升高，而t⁶A、m⁷G、ms²i⁶A、D、m¹G及Ψ等修饰则出现不同程度降低。上述下调可能与胁迫条件下整体代谢与能量供给受限有关：菌体通过重新分配资源，在保证生存与基本翻译需求的前提下降低部分修饰水平，仅维持满足tRNA功能与氨酰化效率所需的最低修饰率；而变化不明显的修饰则提示满足tRNA功能与氨酰化效率在胁迫状态下仍被优先维持，可能具有“house-keeping”性质。值得注意的是，κ²C的核心作用在于保障tRNA^{Ile2（CAU）}对AUA密码子的解码并且抑制对AUG的错误解码，而κ²C缺失会导致密码子误读并降低翻译效率^[32]。因此，κ²C在酸胁迫下的上调提示巴氏醋杆菌可能通过提升AUA相关解码能力参与耐酸适应，甚至可能涉及AUA富集基因的表达调控。这一猜测需进一步实验验证。

Figure 6.  Heatmap showing the dynamic response of tRNA modifications to acid stress

巴氏醋杆菌是醋酸发酵工业的核心菌种，其卓越的耐酸能力构成高效生产的关键基础。尽管已有研究从基因组特征、代谢重编程及细胞膜适应性等方面对巴氏醋杆菌耐酸机制进行了探讨，但从转录后修饰层面，尤其是tRNA修饰角度来解析巴氏醋杆菌环境适应策略的研究仍较为缺乏^[33-35]。本研究首次对巴氏醋杆菌tRNA修饰图谱进行了初步绘制，鉴定获得21种修饰核苷并定位其位点分布，同时揭示了部分修饰在酸胁迫条件下的动态变化，为从表观转录组学视角理解巴氏醋杆菌耐酸生理机制提供了新的数据基础与研究线索。

在技术层面，本研究所采用的RNA修饰鉴定流程仍存在一定局限性，主要体现：①对非序列特异性寡核苷酸片段中检测到的修饰，难以准确归属到具体tRNA分子；②部分同分异构体（如Am与m¹A）在寡核苷酸层面的质谱行为相近、区分困难，因而未纳入最终图谱；③对于丰度较低但基因组中存在同源修饰酶的修饰类型，受检出限影响可能未能在本研究条件下被检出。为进一步提升图谱的分辨率与准确性，后续可结合单体tRNA分离纯化策略，或引入具备修饰识别能力的tRNA测序方法（如m¹A-seq、ICE-seq等）开展更深入解析，这也将是后续工作的重点方向。

本研究结合液相色谱–质谱联用（LC–MS）的核苷分析与寡核苷酸分析，并辅以同源比对策略，对巴氏醋杆菌tRNA修饰开展初步绘制与解析，共鉴定获得21种修饰核苷并实现其在tRNA上的位点定位。具体而言，D、Q、κ²C、Cm、Ψ、ms²i⁶A、i⁶A、m¹G、m²A、t⁶A、ms²t⁶A及m⁷G在核苷分析与寡核苷酸分析中均被检出；ac⁴C仅在核苷分析中检出；而Um、cmnm⁵Um、mnm⁵U、cmnm⁵U及cmnm⁵s²U仅在寡核苷酸分析中检出。此外，基于同源比对结果推测I、gluQ与ho⁵U可能存在。进一步的酸胁迫实验显示，κ²C、t⁶A、m⁷G、ms²i⁶A、D、m¹G与Ψ等修饰水平随环境pH降低发生特异性变化。上述结果提示，tRNA修饰可能通过影响翻译效率和/或翻译保真度参与巴氏醋杆菌对酸性环境的适应性应激调控。