Development of dwarf early-maturing wheat for cultivation in plant factories and identification of early-maturing loci

本研究的实验材料包括119份矮化小麦材料（株高＜50 cm）、‘科农2009’、‘科农2007’、‘科农9204’、‘济试42’、‘济麦20’、‘小偃503’、‘二芒麦’、‘兰考86’和‘矮抗58’等多个小麦品种，所有材料均为凌宏清老师课题组提供。其中，‘R3764-310’为‘宛原选9’与‘石4185’杂交后获得的遗传稳定矮秆小麦品系，属冬性小麦；‘科农9204’为中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心以‘89-6021’与‘SA502’为亲本杂交选育而成的半冬性小麦品种。

所有实验材料均在崖州湾国家实验室植物工厂内完成栽培试验。植物工厂情况如下：配备6套栽培模组，每套模组设3层，每层高度为70 cm；每层上方配置VE02灯管11根，下方设置规格为900 mm×600 mm×30 mm的定植板。栽培系统采用深液流循环方式，每3套模组共用1个独立水箱。工厂内部设有中央空调系统、控湿系统及新风系统，用于调控温度、湿度及空气环境，外接灯光控制系统以实现光照时间的精准设定。

播种前，所有小麦材料均以纯水浸种6 h，随后置于铺有湿润滤纸的培养皿中，在室温、黑暗条件下进行催芽。待种子露白后，将其播种于吸饱水分的海绵块中，海绵块放置于规格为60 cm×29.5 cm×4.9 cm的幼苗托盘内，在每天12 h光照条件培养7 d，期间每2天补充1次叶菜类营养液（购自福建省中科生物股份有限公司）。当幼苗株高达到5 ～ 8 cm时，在10℃、22 h·d⁻¹光照的条件下春化30 d。春化结束后，将幼苗定植于定植板上，株距为10 cm×10 cm，定植后光周期设定为每天18 h光照，环境温度（20± 3）℃，相对湿度（60± 5 ）%，并设置超限报警机制。定植后每3天对营养液浓度及pH值进行监测与调节。其中，营养液浓度以电导率（EC）表示：定植初期EC值设定为（1.2±0.1）mS · cm⁻¹，随后每周递增0.1 mS · cm⁻¹，最终稳定在（1.6±0.1）mS · cm⁻¹，pH5.5 ～ 6.5。

本研究前期在植物工厂条件下对所有材料进行了多轮栽培评价，发现‘R3764-310’在119份矮化品系中较矮且穗部性状较好，而‘科农9204’无需春化就可正常抽穗结实。因此，本研究以‘科农9204’为母本、‘R3764-310’为父本，进行杂交获得F₁后，通过自交获得F₂分离群体，用于早熟遗传位点定位。

进行早熟位点定位时选用外显子混池测序，该方法具有成本低、通量高、数据量小等特点，可从大规模群体中直接筛选出功能区域的共性变异，是进行初步基因筛查和定位的高效工具。在F₂群体中，根据抽穗时间筛选出“早熟”和“晚熟”极端表型个体各20株，分别取其幼嫩叶片，提取DNA，并进行均一化处理后，构建两个极端表型DNA混池（即“早熟池”和“晚熟池”）。对2个DNA混池进行超声破碎处理，将基因组DNA随机打断为300 ～ 500 bp的片段，经琼脂糖凝胶电泳回收目标长度片段后进行末端修复，并在片段两端连接含样本索引序列的测序接头，以区分不同混池。随后通过PCR扩增富集文库片段，并采用磁珠法纯化PCR产物以去除引物二聚体及非特异性扩增片段，获得合格的测序文库。文库构建完成后进行高通量测序，采用150 bp双端测序模式。对获得的原始测序数据进行质量控制，去除接头序列及低质量reads（Q值＜20），获得高质量清洁数据（Clean reads）约50 Gb，对应小麦全基因外显子区域平均覆盖深度约100×。将清洁数据与小麦参考基因组进行比对（采用BWA软件），并利用GATK工具检测两个混池中的单核苷酸多态性（SNP），筛选覆盖深度≥5×、基因型质量值（QUAL≥40的高质量变异位点。在此基础上，进一步筛选在“早熟池”和“晚熟池”之间存在显著等位基因频率差异的多态性SNP，并分析其在染色体上的分布特征，从而定位与小麦生育期性状显著关联的候选QTL区域。最后，根据候选区域内的多态性SNP位点开发分子标记（表1）。

观察和记录抽穗期，小麦成熟后统计株高、有效穗数、穗长、穗粒数等指标，其中株高为海绵块上端至主穗顶端（不含芒）的长度，有效穗数为正常结实穗的数量，穗长为穗基部到顶部（不含芒）的长度，穗粒数为主穗结实的粒数。粒长、粒宽、千粒重等指标通过TPKZ-1-G自动考种分析仪获得。

所有数据采用Microsoft Excel进行整理与统计，图表绘制采用Origin软件完成。

考虑到植物工厂集约化栽培模式需要株矮、早熟且产量优良的小麦品种。因此，将前期选育获得的119份矮化（株高<50 cm）小麦材料在植物工厂条件下进行了3次栽培实验，评价其工厂化栽培适应性，发现‘R3764-310’品系在植物工厂栽培条件下的综合表现良好，其株高为46 cm，适合植物工厂对小麦株高的培养需求。但该材料不经春化处理时不能正常抽穗结实（图1-A），经过1个月的春化处理后，能正常开花结实，整个生育期为108 d，同时该材料在植物工厂中其他农艺性状均较好（图1-B）。由于该品系需要春化，生育期相对较长，不符合植物工厂快速生产的要求，并会增加生产成本，需要进行改良。同时，选取‘科农2009’、‘科农2007’、‘科农9204’、‘济试42’、‘济麦20’、‘小偃503’、‘二芒麦’、‘兰考86’、‘矮抗58’等多个小麦品种，于植物工厂环境中进行种植评价。结果表明‘科农9204’无需春化处理即可正常生长，其生育期约90 d，平均单株穗数为5个，平均每穗达25粒，且株型笔直粗壮，抗倒伏能力强，株高为51 cm，可作为改良‘R3764-310’的亲本（图1-B）。‘科农9204’和‘R3764-310’能够完美地在株高、穗数、生育期、穗粒数等关键性状（如产量和株型）方面形成良好互补，可以满足杂交对亲本性状互补的核心需求，因此，我们以‘科农9204’为母本，‘R3764-310’为父本进行矮秆、早熟小麦新材料的创制。

Figure 1.  Phenotypes and statistic analysis of agronomic traits of ‘Kenong 9204’ and ‘R3764-310’

为了获得矮秆、早熟适宜于植物工厂栽培的小麦新种质，用上述筛选出的适宜植物工厂栽培的早熟品种‘科农9204’为母本，以矮秆品系‘R3764-310’为父本，进行杂交，获得7株F₁代植株。为了进一步确认杂交的准确性，设计了在‘科农9204’和‘R3764-310’之间存在多态性的InDel（Insertion and Deletion）标记，对F₁代植株进行PCR扩增与电泳检测后发现，编号为‘K310-4’和‘K310-6’的植株扩增产物呈现出两条清晰可辨的条带，且两条条带分别与父本‘R3764-310’、母本‘科农9204’的特征条带完全对应（图2-A），表明它们同时携带双亲的遗传物质，可明确判定为杂合基因型植株。

Figure 2.  Confirmation of heterozygous F₁ plants and mapping of the early mature locus

进一步以‘K310-4’为实验对象，通过自交获得了F₂的分离群体。表型观察发现，F₂代植株在没有春化处理时生育期呈明显分离，早抽穗到晚抽穗的表型差异显著，且该群体生育期呈正态分布，最早成熟的材料生育期为63 d，而最晚成熟材料的生育期则为120 d（图2-B）。

为了解析‘科农9204’与‘R3764-310’衍生的F₂群体中控制早熟的遗传位点，我们在该F₂群体中分别挑选了20株早抽穗单株和20株晚抽穗单株，构建了“早熟池”和“晚熟池”。然后对“早熟池”和“晚熟池”DNA进行外显子捕获测序，并通过生物信息学分析，鉴定“早熟池”和“晚熟池”之间的多态性SNP，并统计其在小麦21条染色体上的分布。结果显示，不同染色体的多态性SNP位点数量差异显著：1B染色体检测到33个，数量最多；7A染色体次之，为4个；2A、2D、5B、6A各3个；4A、7B各2个；1A、1D等12条染色体各1个（图2-C）。其中，1B染色体的多态性SNP位点数量远高于其他染色体，提示该染色体可能含有调控生育期的相关遗传区域。为了进一步确定控制早熟位点在1B染色体上的准确位置，本研究对1B染色体上多态性SNPs的分布密度进行了分析，最终将小麦生育期相关基因的候选区域锁定在1B染色体的3～45 Mb区间内（图2-D）。通过与前人已发表的早熟位点进行对比分析表明，该位点是一个全新的小麦生育期控制位点。在此基础上，笔者在该候选区间内根据SNP多态性，设计了4个分子标记（图2-E），对该群体检测，结果发现，这4个SNPs均与生育期呈现紧密连锁，可作为检测该位点的分子标记，为后续精细定位和深入解析该小麦生育期遗传位点提供了分子标记基础。

通过将‘科农9204’与‘R3764-310’进行杂交，获得F₁代杂合植株‘K310-4’，将该材料通过“多代自交+表型鉴定”的方法，围绕植物工厂规模化种植对小麦“矮化、早熟、高产”的核心需求进行选育。首先本研究确定了筛选指标体系：以株高30～45 cm、生育期60～90 d为筛选材料的第1标准，同时将矮化与早熟性状二者兼顾并重，在此基础上进一步选取株型紧凑、分蘖数量多、穗粒数多、单株产量表现优异的材料。在F₂～F₄各世代的种植过程中，按上述指标逐代进行单株筛选与自交纯化，通过连续4代的定向选择，逐步淘汰性状分离的个体材料、富集具有优良性状的个体，最终在F₄代750株材料的种植群体中，获得遗传背景相对稳定、矮化特性稳定且生育期短的优良品系5份：‘K310-4-19-25’、‘K310-4-28-10’、‘K310-4-28-2’、‘K310-4-28-18’和‘K310-4-32-21’。这5份优良品系的株高稳定在37～42 cm，生育期缩短至80 d左右，有效分蘖可达到9～13个，符合植物工厂规模化种植对“株高、成熟期、分蘖力及单株产量”的需求，在植物工厂条件下1年至少可以收获4代，为培育适宜于植物工厂栽培的小麦新品（系）种提供了重要的材料基础，也为未来工厂化小麦生产打下了良好基础。

Figure 3.  Phenotypes and statistic analysis of agronomic traits of selected elite F₄ lines

植物工厂作为依托数字化技术与智慧农业理念的集约化生产系统，其核心优势为小麦育种带来了突破性支撑^[18]。该系统通过传感设备与智能调控技术，实现了光照、温度、湿度及水肥配比的精准控制，彻底消除了自然环境波动与病虫害的干扰，可为小麦生长提供稳定均一的最优环境。而本研究采取每天18 h光照、6 h黑暗的光照组合可有效缩短小麦的生长周期，配合循环水培系统，既可减少水资源与肥料消耗，又实现了零农药使用的绿色生产^[19]。在全球耕地资源紧张、极端天气频发的背景下，植物工厂突破了传统大田农业的局限，推动小麦生产向标准化、规模化、高效化的工业化模式转型。本研究以植物工厂为载体，定向创制适宜于特定栽培场景的小麦种质，为后续其他作物在植物工厂中的种质创制提供了可靠经验。

小麦生育期是决定品种区域适应性及育种周期的核心农艺性状，主要受春化和光周期通路协同调控。其中，春化调控通路相关基因包括Vrn-1、Vrn-2、Vrn-3和Vrn-4，Vrn-1是开花促进因子，在6倍体小麦基因组中有3个同源基因：Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1，分别定位在5AL、5BL和5DL上；Vrn-2是开花抑制因子，定位在第五同源群染色体短臂上；Vrn-3与拟南芥和大麦的FT基因同源，受低温和长日照协同调控，是小麦开花正调控因子，定位于第七同源群染色体上；Vrn-4基因定位于5D染色体短臂靠近着丝粒区域，功能与Vrn-B1、Vrn-D1相似^[20-22]。光周期相关基因主要为Ppd-A1、Ppd-B1和Ppd-D1，分别定位在2AS、2BS和2DS上^{[21, 23]}。本研究在1B染色体3～45 Mb区间定位到控制生育期的相关候选区域及特征SNP位点，与已报道的生育期相关基因定位区域均不同，是目前尚未见报道的全新遗传位点，这一发现为小麦生育期调控提供了新的基因资源和材料资源。笔者认为，该位点的成功挖掘可能与植物工厂独特的种植环境密切相关。

现有小麦生育期研究多基于大田自然环境或传统温室开展，传统温室常采用单一蓝光或红光光源^[24-25]，而本研究使用的植物工厂配备了VE02灯管组合光源，其光谱更为全面，结合精准调控的温湿度、光周期及营养液，形成了更贴近小麦生长需求的最优环境。传统研究中，单一或受限的生长条件可能导致该位点的功能被掩盖，而在植物工厂稳定的栽培条件下，使其调控生育期的效应得以充分显现。这一结果也表明，植物工厂不仅是优质生产平台，更是挖掘作物潜在遗传位点的新研究载体。

通过杂交育种与连续4代自交筛选，本研究培育的小麦新种质完美契合植物工厂规模化种植需求，展现出显著的性状优势。在生育期方面，选育新种质实现了82 d的成熟周期，相较于母本‘科农9204’的90 d生育期缩短了8 d，远优于父本‘R3764-310’的108 d，充分满足了植物工厂高效生产的核心需求。而株高方面，所有优良品系的株高均控制在30～45 cm范围内，符合植物工厂垂直栽培对矮化性状的要求，有效避免了倒伏风险，也为多层栽培的空间利用提供了保障。产量性能上，新种质整合了母本‘科农9204’穗粒数多与父本‘R3764-310’分蘖能力强的优良特性，通过性状互补实现了单株产量的提升，其单株产量优于母本‘科农9204’，为植物工厂小麦规模化生产的高产目标奠定了坚实基础。这些优良性状的聚合，证明了通过定向杂交与多代筛选，能够创制出适配植物工厂环境的专用小麦种质，也为后续主粮作物的工厂化栽培提供了可行的育种思路。

在极端天气频发，耕地紧张，粮食需求不断增大的今天，传统小麦大田生产模式在保障粮食稳定供给的方面，面临严峻的挑战。植物工厂凭借着高度可控且稳定的生产环境与无场地限制的特性，为主粮作物规模化生产在非传统农业空间中的生产开辟出一条新的道路，尤其适用于青海、西藏等耕地资源有限或成都等人口高度集中的地区。本研究创制的矮秆早熟小麦新种质在植物工厂条件下表现出稳定的早熟特性和良好的综合农艺性状，揭示了适宜于植物工厂小麦新种质在未来小麦工厂化规模化种植的潜力。此外，本研究材料在植物工厂条件下可实现1年4代连续生产，相较于传统小麦生产模式显著提高了单位时间和单位空间的生产效率。这种全新高效的生产模式不仅有助于提升粮食供给能力，也为加快优良性状的遗传改良和新品种选育提供了有利条件。从应用角度来看，位于1B染色体上的早熟新位点及其所携带的矮秆早熟种质，为植物工厂专用小麦的进一步改良提供了关键的遗传基础。后续研究可围绕该位点开展更为精细的定位与功能解析，并在不同植物工厂运行条件下，对相关新品种的产量表现和稳定性进行系统评估。同时，结合商业化生产条件下的规模化试验，进一步分析其通过提高年复种指数所带来的单位面积经济效益提升潜力。

本研究围绕植物工厂规模化种植对矮秆、早熟小麦种质的需求，以定向杂交、多代自交筛选与分子遗传定位为核心技术路线开展研究，最终达成预计目标。首先通过筛选出性状互补的亲本，为种质创制奠定基础；其次，借助外显子混池测序技术在1B染色体3～45 Mb区间成功定位到与小麦生育期显著关联的候选区域并开发紧密连锁SNP标记，填补了植物工厂环境下小麦生育期调控新基因的研究空白。再者，通过连续4代自交与定向表型筛选，创制出5份适配植物工厂栽培的小麦新种质，其株高稳定在30～45 cm、生育期缩短至82 d（可实现1年4代），且所选材料聚合了双亲分蘖能力强与穗粒数多的优势，单株产量皆优于母本‘科农9204’，符合植物工厂株矮，生育期短和产量高的需求；同时，验证了植物工厂作为小麦育种与遗传研究平台的独特价值，其精准可控的环境不仅保障育种筛选准确性，还能显现传统环境中被掩盖的遗传位点功能，为作物专用种质定向创制提供新路径。此外，研究因样本量限制未能充分挖掘更极端优异材料，未来可通过扩大群体规模，精细定位目标基因、验证基因功能，并进一步优化新种质的产量与环境适应性。本研究创制的新种质及相关技术方法，也为植物工厂小麦规模化生产及其他主粮作物工厂化适配育种提供了新材料和新思路。