Arabidopsis lectin-like receptor kinase LecRK-I.7 positively regulates the disease resistance against Oidium heveae

供试菌株为橡胶树白粉菌Oidium heveae HN1106。利用橡胶树热研‘73397’古铜期叶片活体（离体？）传代培养橡胶树白粉菌Oidium heveae HN1106。温室培养条件为温度28℃，相对湿度85%，光照16 h/黑暗8 h。

供试拟南芥为野生型拟南芥Col-0。拟南芥凝集素类受体激酶突变体lecrk-1.7为实验室保存。拟南芥温室培养条件为温度23℃，相对湿度85%，光照10 h/黑暗14 h。

根据T-DNA插入位点，在插入位点上下游各取500 bp分别设计正反向引物，利用3'引物法进行PCR扩增，根据结果鉴定是否为突变体纯合系。引物序列：

LecRK-I.7 F：5'-CCCTGGTGGAGAAGCCTTGC-3'

LecRK-I.7 R：5'-TTCCAAAATAGCATAACCAT-3'

利用活体接种的方法，剪取接菌后8～10天带有橡胶树白粉菌生理小种O. heveae HN1106成熟孢子的橡胶树叶片，用毛刷将白粉菌从叶片均匀刷到孔径为50 μm的尼龙膜接种箱，最终使白粉菌均匀落下至4周龄拟南芥叶片上，每片橡胶树叶片产生的成熟孢子接种大约24株拟南芥。

针对LecRK-I.7基因设计上下游引物，PCR后，胶回收，采用诺唯赞同源重组试剂盒连接至pER8载体。测序验证后，转化农杆菌感受态细胞GV3101，利用浸花法进行转基因操作。收种后，利用1/2 MS培养基进行筛选，培养条件为温度23℃，相对湿度85%，光照10 h/黑暗14 h。

引物序列如下：

LecRK-I.7 cDNA F：5'-GACGAGCTCGGTACCATGATTCGAGGATTGCTTTT-3'

LecRK-I.7 cDNA R：5'-TCTTTGTGATCTTCGAATCGCCCACTCCCGTAGAGGA-3'

采用biosahrp公司（中国北京，兰杰柯科技有限公司）植物样本总RNA提取试剂盒提取拟南芥Col-0和突变体lecrk-1.7幼苗叶片总RNA，经过biosahrp公司反转录试剂盒反转录为cDNA。使用SYBR Green qPCR Mix试剂盒进行荧光定量PCR，每个反应体系共20 μL，2XSYBR MIX（TAKARA）酶10 μL，Rox dye 0.4 μL，正反向引物各0.4 μL，cDNA模板5 μL，水3.8 μL。

引物序列如下：

ACTIN：5'-TGGTGGAAGCACAGAAGTTG-3'；

5'-GATCCATGTTTGGCTCCTTC-3'；

LecRK-I.7 RT：5'-GGGACATCGCATCGACTCTTA-3'；

5'-CCGGGTTCCACAGGTCTCC-3'。

设计GFP基因上下游引物，克隆GFP基因，测序验证后，插入构建完成pER8-LecRK-I.7载体。引物序列如下：

LecRK-I.7 GFP F：5'- GACTCTAGCCTCGAGATGATTCGAGGATTGCTTTT-3'；

LecRK-I.7 GFP R：5'- GATAGCCTCGAGATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3'。

拟南芥转基因植株至5周，使用雌激素处理，36 h后，剪取叶片，加入蛋白提取液，使用研磨棒磨碎，离心（4℃，12 000 r·min⁻¹，10 min）。吸取上清液，加入loading buffer，于100℃金属浴加热10 min。

利用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，湿法转印至PVDF膜，5%脱脂奶封闭2 h，一抗4℃孵育2 h，TBST洗膜3次后，二抗室温孵育0.5 h，再次洗膜，加入ELC化学发光液，曝光成像。

白粉菌接种后10 d，取8片接菌叶片置于50 mL离心管中，加入5 mL叶片脱色液，待叶片完全脱色，使用考马斯亮蓝染色液对叶片染色，使用显微镜观察^[18]。显微镜下找到可以产生分生孢子梗的孢子，并对其产生的分生孢子梗数量进行统计，通过3次独立的接种实验完成统计，每次实验每个基因型植物统计超过20个孢子形成的分生孢子梗数量。

在玻璃管中加入4 mL台盼蓝染色液，取4片预接了白粉菌的叶片于玻璃管中，将玻璃管放入水中加热，水沸后计时10 min，关火，待叶片在水中自然放凉，6～8 h后将台盼蓝染色液换为水合氯醛，放置12 h后更换水合氯醛，重复更换3～4次，至叶片完全脱色，使用显微镜观察^[18]。并计算每0.25 cm²叶片的细胞死亡面积占比。每个基因型植物观察8～12片接种叶片，分别通过3次独立的接种实验完成统计。

将含有目的基因农杆菌GV3101进行划线活化，置于5 mL LB液体培养基中培养。28℃，180 r·min⁻¹振荡培养48 h后，吸取2 mL农杆菌菌液，5 000 ×g，离心10 min，去上清液。用缓冲液（10 mmol·L⁻¹ MgCl₂）漂洗3次，调至 OD 值0.5～0.6，进行注射。

剪取单个穴盘中生长4周龄拟南芥植株的地上部分，清除附着的泥土后立即称量，记录湿质量。将样本置于65℃恒温烘箱，每24h称量至质量恒定，记录质量，计算每64 cm²生物量。每个基因型植物测量6个穴盘。

称取 0.1 g拟南芥叶片鲜样，剪成0.5 cm左右的碎片，放入干燥的50 mL试管，向试管中加入8 mL 95%乙醇，确保叶片碎片完全浸没在溶液中，室温避光静置浸泡36 h至叶片完全变白。分光光度计分别测定提取液在665 nm和649 nm波长下的吸光度值，最终计算叶绿素含量。

采用Graphpad Prism 10（美国波士顿，GraphPad Software公司）软件对qPCR数据结果进行统计分析及作图。利用Smart软件（https://smart.embl.de/）对LecRK-I.7蛋白结构进行预测。

提取野生型拟南芥Col-0和凝集素类受体激酶LecRK-I.7基因T-DNA插入突变体lecrk-1.7（SAIL_-717_-B11）基因组DNA，LecRK-I.7基因由1个外显子编码，T-DNA插入位置为1 792 bp，插入方向为正向插入（图1-A），并通过三引物法验证纯合突变体植株。结果表明，利用T-DNA插入位点上下游引物进行PCR扩增，只有Col-0扩增出目的条带（图1-F），突变体不能扩增出特异性条带（图1-F）；因T-DNA插入方向为正向插入，利用T-DNA引物和插入位点下游引物进行扩增，lecrk-1.7突变体1～10均扩增出目的条带（图1-G），而野生型Col-0未扩增出目的条带（图1-G）。这说明10株lecrk-1.7均为突变植株纯合系。纯合系突变体植株种植过程中，对生长4周龄的植株大小进行观察（图1-B），并且统计了地上生物量（图1-D）和叶绿素含量（图1-E）及抽苔后的株高（图1-C）。结果表明，突变体与野生型Col-0植株相比，差异性不显著；SAIL_717_B11突变体未表现出明显生长性状差异。

Figure 1.  The characterization of homozygous T-DNA insertions of lecrk-1.7 mutants

选择生长期为4周龄拟南芥Col-0和lecrk-1.7植株同时接种O. heveae，接种10 d，lecrk-1.7叶片出现点状白粉病病斑（图2-A），而Col-0叶片表现黄化的症状（图2-A），可以初步确定LecRK-I.7基因参与了拟南芥抗对白粉菌的抗病性。进一步通过对接菌10 d的Col-0和lecrk-1.7叶片进行考马斯亮蓝染色。显微镜观察显示，与野生型Col-0相比，突变体lecrk-1.7叶片上形成了更为浓密的菌丝网络，且有少量分生孢子的产生，而Col-0叶片上仅形成稀疏的菌丝网络，未观察到分生孢子的产生（图2-B，F）。同时， O. heveae在lecrk-1.7激发的细胞死亡和活性氧比在野生型Col-0都显著降低（图2-C，D），这进一步说明了凝集素受体激酶基因LecRK-I.7对O. heveae发挥抗病功能。

Figure 2.  The LecRK-I.7 gene positively regulates Arabidopsis resistance to O. heveae

在Col-0和lecrk-1.7接种O. heveae 2 d时，剪取叶片进行考马斯亮蓝染色。显微镜观察发现，突变体lecrk-1.7叶片上形成树枝状菌丝网络，菌丝长度约340 μm，而野生型仅形成2根菌丝，长度约150 μm，差异显著（图2-E）。接种O. heveae 2 d的Col-0和lecrk-1.7经台盼蓝染色后，经显微观察发现，Col-0叶片在O. heveae菌丝生长部位引发明显细胞死亡，而在突变体O. heveae菌丝生长部位未观察到细胞死亡（图2-G，H），这暗示着LecRK-I.7同时参与对O. heveae的早期抗病性。

实验室（海南大学植物白粉病抗性分子育种研究室）通过前期RNA-seq数据发现LecRK-I.7基因在O. heveae侵染12 h时发生了上调表达，但为了进一步探索LecRK-I.7在白粉菌侵染过程中的表达模式，本研究团队对接菌后0 、1 、2 、3 、6 、12 、24 和48 h的Col-0取样，提取总RNA并进行反转录后，利用荧光定量PCR检测LecRK-I.7的表达水平，结果发现，与0 h相比，LecRK-I.7基因在白粉菌接种后3、6、12 h均发生了不同程度的上调表达，接种12 h后LecRK-I.7的表达量达到最高，是接种0 h的6倍左右。接种24 h后，基本回复到0 h正常水平（图3）。O. heveae在拟南芥侵染后12 h是第一根芽管形成附着孢刺入植物细胞形成初生吸器的关键阶段，因此推测LecRK-I.7基因可能在白粉菌进入植物细胞阶段表达发挥抗性功能。

Figure 3.  The expression of LecRK-I.7 gene is induced and upregulated by O. heveae

凝集素类受体激酶定位于植物细胞膜发挥功能^[9]。通过蛋白结构预测发现LecRK-I.7蛋白具有胞内激酶结构域、胞外凝集素结构域和2个跨膜结构域，跨膜结构域分别位于233-255 AA和286-308 AA，因此推测LecRK-I.7基因定位于植物细胞膜发挥功能。为了确定LecRK-I.7基因是否定位于植物细胞膜，本研究构建了35S组成型启动子驱动的LecRK-I.7-GFP融合表达载体，利用农杆菌转化，将LecRK-I.7-GFP基因转入拟南芥Col-0，并筛选出阳性转基因植株，通过激光共聚焦显微镜对其叶片进行观察。结果发现，在488 nm激发光下，LecRK-I.7-GFP融合蛋白的绿色荧光信号主要分布于细胞膜（图4-A），对照GFP在细胞膜、细胞核和细胞质均有表达（图4-A）。利用本生烟瞬时表达系统，分别注射含有GFP空载体和LecRK-I.7-GFP载体的农杆菌，并用细胞膜染料FM4-64处理注射叶片，结果与拟南芥转基因相似，细胞膜、细胞核和细胞质均可以观察到对照GFP的存在，而LecRK-I.7-GFP融合蛋白的绿色荧光信号主要分布于细胞膜并与FM4-64信号相融合（图4-B），暗示着LecRK-I.7基因主要定位于细胞膜发挥功能。

Figure 4.  The LecRK-I.7 gene is mainly localized to the plant cell membrane

本研究构建了35S组成型启动子驱动的LecRK-I.7-FLAG融合表达载体，导入农杆菌，将LecRK-I.7-FLAG载体转化拟南芥lecrk-I.7突变体，利用免疫印迹筛选出高表达阳性转基因植株Line 4和Line 5（图5-B），通过表型观察，2个高表达阳性转基因植株Line 4和Line 5与突变体lecrk-1.7相比，未表现出明显抗性表型（图5-A）。分别对Col-0、lecrk-1.7突变体和2个LecRK-I.7转基因植株接种O. heveae，接种后10 d，野生型Col-0和2个LecRK-I.7转基因系叶片均表现典型黄化症状（图5-C），而lecrk-1.7叶片出现白粉病点状病斑（图5-C），未表现出发黄表型。进一步通过考马斯亮蓝染色，显微观察发现O. heveae在Col-0和2个LecRK-I.7转基因系形成相似的菌丝网络，未检测到分生孢子的产生，而在突变体lecrk-1.7形成浓密的菌丝网络和少量的分生孢子（图5-D）。利用台盼蓝和DAB染色，经显微观察发现在接菌后转基因叶片与野生型Col-0叶片均表现出明显细胞死亡与活性氧产生（图5-D）。进一步统计活性氧产生（图5-F）和细胞死亡（图5-E）面积百分比，野生型Col-0和2个转基因系与lecrk-1.7突变体存在显著差异，说明LecRK-I.7回复了突变体lecrk-1.7对O. heveae的抗病性。

Figure 5.  Overexpression of LecRK-I.7 rescues the resistance of the lecrk-1.7 mutant to O. heveae

橡胶树白粉病是橡胶树上危害严重的叶部病害，橡胶树白粉菌是一种专性寄生真菌，然而其与寄主互作的分子机制研究相对滞后^[19]。G型凝集素受体激酶VqLecRK1基因具有增强葡萄抗白粉病的功能^[20]。L型凝集素受体激酶LecRK-V在转基因小麦植株中赋予对白粉病的广谱抗性^[17]。然而，凝集素受体激酶是否参与对O. heveae的抗病性，目前仍然是未知的。本研究前期（数据尚未发表）通过RNA-seq数据分析发现凝集素类受体激酶LecRK-I.7受橡胶树白粉菌诱导上调表达，推测LecRK-I.7对O. heveae可能发挥抗病功能。通过鉴定LecRK-I.7基因T-DNA插入突变体SAIL_-717_-B11纯合系，与野生型Col-0相比，突变体未表现出地上生物量、叶绿素和株高等生长性状显著差异。进一步在lecrk-1.7突变体接种O. heveae，发现O. heveae可以形成比Col-0更为浓密的菌丝网络和少量的分生孢子，以及激发的细胞死亡和活性氧也大大降低，这暗示着LecRK-I.7参与了拟南芥对O. heveae的抗病性。同时，利用回补实验，本研究构建了LecRK-I.7在lecrk-1.7突变体背景下的过表达转基因植物株。接种O. heveae，转基因植株可以回复突变体对白粉菌的抗病表型，从遗传学上进一步证实了LecRK-I.7抗病功能。然而，未接菌时，过表达转基因植物与lecrk-1.7突变体无明显生长表型差异，推测LecRK-I.7识别白粉菌并与相应PAMPs结合后才能发挥抗病功能。

LecRLKs定位于植物细胞膜，利用胞外凝集素结构域识别病原菌相关分子模式（PAMPs, Pathogen-Associated Molecular Patterns）或寄主细胞表面的损伤相关分子模式（DAMPs, Damage-Associated Molecular Patterns），进而启动下游免疫信号传导^{[9, 21]} 。因此，膜定位对于LecRLKs功能的正常发挥至关重要。蛋白结构预测分析，LecRK-I.7具有胞内激酶结构域、胞外凝集素结构域和2个跨膜结构域，跨膜结构域分别位于233-255 AA和286-308 AA，这与本研究得出的LecRK-I.7膜定位结论相一致，确定LecRK-I.7作为膜受体感知O. heveae的入侵。PTI信号通路通常在病原微生物与植物互作的早期被激活，荧光定量PCR发现，在O. heveae侵染的过程中，LecRK-I.7在侵染后的3～12 h均表现上调表达，12 h表达量达到最高，24 h后回复到正常水平。白粉菌侵染后的6～12 h是白粉菌入侵进入植物细胞的关键阶段，暗示着LecRK-I.7可能在该时间段阻碍了白粉菌的进入。进一步的台盼蓝染色分析发现，接种后2 d，O. heveae在Col-0进入植物细胞的位置形成明显可见的细胞死亡，而在lecrk-1.7突变体未发现细胞死亡，并且形成了显著长于Col-0的菌丝长度，这表明LecRK-I.7识别O. heveae后激发了细胞死亡从而抑制了菌丝的生长。而后期O. heveae在lecrk-1.7突变体诱导的细胞死亡可能是LecRK-I.7突变后导致大量白粉菌进入植物细胞从而激发的ETI抗性。不同类型凝集素类受体激酶识别的PAMPs不同，拟南芥G型凝集素受体激酶LORE可以感知细菌中链3-羟基脂肪酸（mc-3-OH-FA）^[22-24]，拟南芥L型凝集素受体激酶LecRK-IX.2特异性识别细菌鞭毛蛋白保守肽段flg22^[12]，关于LecRK-I.7识别的O. heveae PAMPs，在未来的研究中可以通过LecRK-I.7转基因植物接种白粉菌后，利用免疫沉淀质谱的方法进行分离。

植物与病原微生物长期互作过程中，植物进化出2层次的免疫系统PTI和ETI识别病原微生物的入侵，激发抗病反应。PTI和ETI信号通路既独立存在也相互交叉，协同抵御病原微生物的侵染。有研究报道表明O. heveae在拟南芥激发依赖于EDS1的抗病反应，并且TNL类蛋白家族WRR4可以识别O. heveae，激发ETI信号通路^{[25- 26]}。本研究发现拟南芥凝集素受体激酶LecRK-I.7激发的PTI信号通路也参与对O. heveae的抗病性，这说明拟南芥PTI和ETI对O. heveae共同发挥抗病功能。PTI和ETI信号通路存在相互交叉，WRR4B通过正调控EDS1（Enhanced Disease Susceptibility 1）正反馈调控环相关基因表达，对白粉菌发挥广谱抗病功能；鉴于EDS1同时也参与PTI信号通路，并且eds1突变体对O. heveae表现完全感病性^[27]，故推测LecRK-I.7激发的抗病通路可能也依赖于EDS1，这一推测仍需要进一步实验证明。另外，拟南芥其他凝集素类受体基因是否参与对O. heveae的抗病性，及LecRK-I.7与抗性蛋白WRR4B是否在O. heveae抗病信号通路存在遗传上下游关系，也需要进一步验证。