Geographical variation in floral traits and pollination adaptation of floral color diversity of Primulina heterotricha (Gesneriaceae), an endemic species of Hainan Island, China

烟叶报春苣苔是苦苣苔科（Gesneriaceae）苦苣苔亚科（Cyrtandroideae）报春苣苔属（Primulina）的植物，为海南岛特有种，广泛分布于海南热带雨林国家公园。该种生长于山谷林中或溪边石上，在石灰岩与非石灰岩生境中均有分布，海拔范围为300～1,300 m^{[10, 15]}。该种为多年生草本，花筒呈漏斗状，花冠为紫色或黄色、两侧对称，花筒内具2或3个斑点作为蜜导；雄蕊2枚、合生，可全年开花（图1）。

Figure 1.  Plants of Primulina heterotricha with purple flowers (A)and pale yellow flowers (B), sampling site of the purple-flowered population (C)and pale yellow-flowered population (D)

为明确烟叶报春苣苔不同地理种群花部特征的分化规律，在整个分布区选取不同地理种群开展野外调查。根据生境异质性及地理隔离程度，共设置8个地理种群（附表1）。在盛花期，随机选取20株以上的健康植株，每株选取2～3朵盛开的花进行测量。根据方差分析的要求，每个种群至少采集30朵花的数据（附表2）。在野外，采用游标卡尺（精度0.01 mm）对以下3个关键花部性状进行测量：花大小（花冠最大横向直径）、花喉宽度（花冠喉部最窄处的横向距离）及花筒长（从花冠喉部处至花筒基部的纵向长度）。同时，记录每个种群的经纬度和海拔高度，并基于地理坐标通过ArcGIS 10.8软件^[23]计算种群间的直线距离（单位：km）。

所有花部特征的数据均经过正态性检验和方差齐性检验，符合参数检验条件。数据分析在R 4.4.3软件^[24]中完成，显著性水平设为P<0.05。首先，以地理种群为分组变量，分别对花大小、花喉宽度和花筒长进行单因素方差分析（one-way ANOVA），检验不同地理种群间单一花部特征的差异显著性，该分析通过rstatix包^[25]完成。其次，以花大小、花喉宽度和花筒长的组合为响应变量，进行多元方差分析（MANOVA），检验地理种群间花部特征组合的整体差异，该分析通过car包^[26]完成。最后，采用皮尔逊（Pearson）相关系数分析花大小、花喉宽度和花筒长的整体相关性，通过显著性检验判断相关性的统计学可靠性，该分析用corrplot包^[27]完成。

为探究地理距离、海拔对整体花部性状的影响，以地理距离、海拔为自变量，花大小、花喉宽度和花筒长为因变量，利用基础函数lm进行线性回归分析。

为探究烟叶报春苣苔不同花色种群的开花动态差异，选取紫花、黄花各1个种群开展开花动态研究。其中，紫花种群位于昌江黎族自治县王下乡王下河河谷（109º07′05.10″ E，19º01′26.27″ N，海拔450 m）（图1-C）；黄花种群位于霸王岭东一林场附近（109º09′36.73″ E，19º07′13.46″ N，海拔1,011 m）（图1-D）。

2025年5月24日至10月29日，对上述两个监测种群的固定样地开展定点连续观测，对种群物候进行为期7～10天的连续记录与拍照，同时记录每日天气状况，尽可能控制天气因素对访花昆虫的潜在影响。在两个种群中分别选取30株处于花苞期的植株进行挂牌标记，对其开花动态实施连续观察：采用精度为1 mm的电子游标卡尺测定花大小、花喉宽度、花筒长、雄蕊长（花药至花筒底部的距离）、花柱长（柱头至花筒底部的距离）、雌雄异位（herkogamy）程度（花药与柱头间的距离）等花部性状，每隔2 h观察记录一次，直至柱头萎蔫。

采用单因素方差分析和多元方差分析检验花色对花部特征的影响。针对花大小、花喉宽度、花筒长3个特征，分别以花色为自变量进行单因素方差分析，检验不同花色在单一花部特征上的差异显著性。为检验花色对花部特征组合的整体效应，将3个花部特征作为联合因变量，以花色为自变量进行多元方差分析，进一步验证花色对花部特征协同变异的影响。

为明确烟叶报春苣苔不同花色种群的访花昆虫组成及传粉行为差异，针对上述两个种群的访花昆虫及行为进行连续7-10天观察，每日观察时段设定为上午9:00至下午17:00。观察时选取处于盛花期的开放花朵，实时记录昆虫访花相关数据，具体包括昆虫访花时间、昆虫数量、昆虫种类、单只昆虫停留时间、同一昆虫在同一时间段内访问的花朵数量等；同时进行视频拍摄，详细描述昆虫的访花行为特征。观察过程中重点关注传粉昆虫与花内各器官的接触情况，其中能够同时接触到柱头和花药的昆虫被界定为有效传粉昆虫。

在所有地理种群中，烟叶报春苣苔的花部特征测量结果如下：花大小均值为2.26±0.09 cm，花喉宽度均值为0.94±0.06 cm，花筒长均值为4.07±0.11 cm（图2）。单因素方差分析结果显示，不同地理种群间的三个关键花部特征均无显著差异：花大小（F = 0.919，P = 0.996）、花喉宽度（F = 0.408，P = 1.00）及花筒长（F = 0.292，P = 0.991），表明地理因素对各花部特征的独立影响不显著。

Figure 2.  Floral traits of different geographic populations of P. heterotricha (■ Floral size; Floral mouth width; □ Corolla length)

多元方差分析表明，不同地理种群间的花部特征组合（花大小、花喉宽度及花筒长）存在显著差异（Pillai = 0.176，P = 0.0035；Wilks = 0.826，P = 0.0020；Hotelling-Lawley = 0.207，P = 0.0011；Roy = 0.194，P = 6.31×10⁻⁷），四种检验方法均显示地理因素对花部特征整体表型有显著影响。其次，任意两地理种群间的花部特征整体表型没有差异（P>0.05）。

花大小和花喉宽度呈极强正相关（r = 0.987，P = 9.92×10⁻¹⁹²），花大小和花筒长呈极强负相关（r = −0.989, P = 1.55×10⁻¹⁹⁸），花喉宽度和花筒长呈极强负相关（r = −0.990，P = 4.54×10⁻²⁰⁶）。

地理距离与花部特征的线性回归分析显示，地理距离与花大小（P = 0.9995）、花喉宽度（P = 0.9863）及花筒长（P = 0.9336）均无显著相关性。海拔与花部特征的线性回归分析显示，花大小（P = 0.8323）、花喉宽度（P = 0.8303）和花筒长（P = 0.9742）均与海拔无显著相关性。所有指标的回归系数接近0，且R²值极小（图3）。

Figure 3.  Linear relationships between floral traits and altitude (A)and geographical distance (B)

在花部特征方面，选取两个不同花色种群各30朵成熟的花冠进行测定（附表3）。黄花种群花大小平均值为2.12±0.02 cm，花喉宽度为0.90±0.02 cm，花筒长为4.04±0.04 cm；紫色花冠种群花大小平均值为2.13±0.02 cm，花喉宽度为0.90±0.02 cm，花筒长为4.05±0.04 cm（附表3, 图4）。单因素方差分析结果显示，不同花色在三个关键花部特征上均无显著差异：花大小（F = 0.337，P = 0.564）、花喉宽度（F = 0.444，P = 0.508）及花筒长（F = 0.108，P = 0.743），表明花色对各花部特征的独立影响不显著。经过多元方差分析进一步检验，花色对花部特征组合的整体效应，即花色对花大小、花喉宽度和花筒长的协同变异无显著影响（Wilks = 0.9574，P = 0.5071）。

Figure 4.  Floral traits of the purple and yellow-flowers of P. heterotricha

基于本研究前期野外实地系统观察，结合单花发育全过程的动态追踪记录，依据柱头是否伸长、弯曲角度等形态特征，以及是否脱离花筒喉部等空间位置变化，可将烟叶报春苣苔单朵花的生活史划分为以下六个阶段：（1）花蕾期：花冠呈紧实花骨朵状，尚未开放；（2）始花期：花朵刚刚开放，柱头尚未伸长；（3）伸长期：柱头开始显著伸长，脱离花筒喉部区域，其形态变化肉眼可清晰观察；（4）弯曲期：伸长后的柱头出现明显的弯曲生长趋势；（5）反折期：柱头弯曲角度超过90°，且弯曲程度随发育进程持续加大；（6）落花期：花冠完全脱落，仅残留花柱，此时自然授粉过程已完成。

开花进程与花期特征如下：单朵花从发育完全的花蕾到花冠裂片完全展开约耗时1天，开裂过程具有特定顺序——花朵下唇的右裂片先伸展张开，随后左裂片向左方展开，此时下唇的中裂片被上唇包裹；2～3小时后，上下唇裂片完全分离，各自向上下方向展开，开放约2～3小时后，裂片完全舒展，花朵进入正式开放状态。单朵花的花期约为5～7天，整个种群的花期主要集中在3～11月，其余时间偶有零星开花现象。

烟叶报春苣苔的合生花药始终保持在花筒喉部位置，花柱在始花期在雄蕊后方，在伸长期、弯曲期和反折期从花筒喉部位置逐渐伸长并弯曲，雌雄异位程度相对变化较小（图5）。两种花色种群在不同开花阶段雄蕊长、雌蕊长和雌雄异位程度没有显著差异（P>0.05；附表4；图5-A–B），三个指标变化趋势一致。

Figure 5.  Change of pistil and stamen length and herkogamy of purple (A)and yellow (B)flowers of P. heterotricha at different flowering stages.

黄花个体的主要访花者为黄黑无垫蜂（Amegilla leptocoma）和云南无垫蜂（A. yunnanensis）（图6-A–B），紫花个体主要访花者为黄黑无垫蜂（图6-C–D）。两种访花者均通过头部和背部接触花药与柱头，均属有效传粉者，且不同花色种群的访花昆虫行为无差异。所有访花者单花停留时间为2～3秒，单次访问花朵数量为3～8朵。在每日平均7小时的传粉观察中，黄花种群的黄黑无垫蜂与云南无垫蜂总访花次数为75次左右，其中黄黑无垫蜂47次（占比62.7%）、云南无垫蜂28次（占比37.3%）；紫色花冠种群黄黑无垫蜂的访花次数为56次。

Figure 6.  Pollinators of purple (A, B)and yellow (C, D)flowers of P. heterotricha

在苦苣苔科植物中，传粉者介导的花部综合征对物种分化具有重要作用^[28]，因此可通过花表型特征预测该类群的花部综合征及传粉者类群^[28-29]。烟叶报春苣苔的花部特征表现为漏斗状花冠、两侧对称，花色呈紫色或黄色，且主要以少量花蜜和花粉作为传粉回报物，基于这些特征可推测其主要传粉者为蜂类^{[14, 30]}。花大小、花喉宽度和花筒长与访花者体型大小密切相关，是决定昆虫能否顺利进入花冠筒完成传粉过程的关键功能性状^{[29, 31]}。单因素方差分析表明，烟叶报春苣苔不同地理种群的花大小、花喉宽度及花筒长均无显著差异，表明地理隔离没有驱动单一花部特征的定向分化。而三者的特征组合呈现显著分化，且任意两种群间未呈现种群特异性的分化模式，表明该分化并非种群特异性。功能性状的相关性常反映协同适应策略，三个花部特征具有极强的相关性，表明该花部结构可能具有功能协同性，是地理因素介导下不同花部特征的组合优化。其次，相关性分析显示，地理距离、海拔与花部特征组合无显著关联，表明该分化并非由距离或海拔梯度下的环境筛选所导致。

海南岛和邻近地区具有相似的传粉模式，以蜂类传粉最为常见传粉机制^{[30, 32-33]}。蜂类传粉机制被认为比鸟类传粉更加泛化^{[31, 34]}。烟叶报春苣苔的主要传粉者为黄黑无垫蜂和云南无垫蜂，这两种传粉者广泛分布于海南热带雨林国家公园^[35]。海南岛山脉地形复杂、沟壑纵横，孕育出该岛近80%的特有植物^[2]。这种复杂山脉形成的地理隔离，可能先阻碍黄黑无垫蜂和云南无垫蜂的基因交流，驱动其种群分化为具有体型、行为差异的局部种群；进而对烟叶报春苣苔的花大小、花喉宽度、花筒长等与传粉者体型适配的关键功能性状施加定向选择，促进了烟叶报春苣苔花部特征的地理变异。未来仍需通过系统性传粉观察，探究不同地理区域的传粉者类群组成及形态、行为特征的变异情况，明确花部特征地理变异的根本原因。

花色对于吸引传粉昆虫至关重要，色彩艳丽的花朵更易引发传粉者的访花行为^[36]。蜜蜂对黄色、紫色和白色最为敏感^[37]，能将人类视觉中的紫色识别为紫色、将黄色识别为蓝绿色^[38-39]，而烟叶报春苣苔的黄色与紫色花冠均在蜜蜂的敏感色谱范围内，推测其可被主要传粉者有效识别。尽管两种花色种群的花部形态、开花动态无显著差异，但花色作为传粉者视觉识别的关键信号，其是否影响传粉者访花偏好仍需实证验证。其次，两种花色的种群在花期、传粉者种类上表现出不同。其中，黄花种群的盛花期为4～10月，紫花种群盛花期则延迟1～2个月。

黄花种群的传粉者主要为黄黑无垫蜂和云南无垫蜂，而紫花种群的传粉者以黄黑无垫蜂为主。类似现象在海南岛特有种海南凤仙花（Impatiens hainanensis）中也有发现，其传粉者因生长海拔不同而存在差异^[35]：低海拔区域中传粉者为黑黄无垫蜂，高海拔区域中则为绿条无垫蜂（A. zonata），但该物种未发生传粉生态型的分化。黄黑无垫蜂雄蜂体长14～16 mm，雌蜂体长13～16 mm；云南无垫蜂雄峰体长15～16 mm，雌蜂体长13～15 mm^[40]，两种蜂类体型大小相差不大。从协同进化的角度，体型相同的传粉者不易形成明显的选择压力差异，导致花部形态基本保持一致。其次，烟叶报春苣苔紫色和黄花种群基因流较弱^[17]，花色多态性的维持可能与种群生境条件的影响有关。

总之，烟叶报春苣苔不同地理种群的花部特征有显著差异，表明该类群的花部形态已产生地理变异，可能与传粉者类型或体型的改变有关。尽管烟叶报春苣苔存在黄花与紫花两种个体，但不同花色种群在花部特征、开花动态等特征上均无显著差异，表明传粉者并非驱动其花色分化的关键因素。花色多样性的形成机制仍需深入探究，未来可从分子角度研究花色多样性形成的根本原因。本研究明确了海南特有植物烟叶报春苣苔在海南热带雨林国家公园花部特征的地理变异和花色多样性的传粉适应，不仅揭示了该植物的传粉和局域生态适应过程，也为海南热带雨林国家公园生物多样性保护和传粉服务功能评估提供了科学支撑。