Cloning and expression analysis of PvMYB1 in Paspalum vaginatum

本试验材料为海雀稗‘USA17-18’种质资源，现保存于海南大学儋州校区农科基地。

参照陈静波等^[18]的试验方法，剪下‘USA17-18’海雀稗顶端三节匍匐茎，挑选生长一致的匍匐茎用棉花固定在剪去尾部的离心管中于1/2 Hoagland营养液（pH 5.8）中预培养17 d，参考申晴等^[19]方法，分别进行以下处理①分别在0、15、30 g·L⁻¹ NaCl处理液中（pH 5.8）持续水培14 d，采集叶片与根系组织样本，用于后续RNA提取及相关基因表达研究。②在30 g·L⁻¹ NaCl处理液中（pH 5.8），设置不同时间处理，分别为0（CK）、5、10 d，收取叶和根系样品用于RNA提取和基因表达分析。

参考黄杰等^[20]方法，使用 EPSON 12000XL 扫描仪（日本）扫描海雀稗根系图像。借助WinRhizo Pro软件（Regent Instruments，加拿大）测定盐胁迫下植株的总根长、根表面积及根体积等参数，完成定量评估。

参照邹晓燕等^[21]方法用TRNzol试剂（TIANGEN ，中国）提取海雀稗RNA。海雀稗根叶组织的RNA提取步骤如下：称取0.1 g样本，加入1 mL TRIzol提取液，经破碎仪充分破碎。加入200 µL三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温静置3 min。4℃条件下11 999 rpm离心15 min，收集上清液转移至新1.5 mL离心管。加入等体积异丙醇，震荡混匀后置于-20℃反应2 h。4℃ 11 999 rpm离心10 min，去除上清液。加入500 µL无水乙醇清洗沉淀，4℃ 10 000 rpm离心5 min后去除上清液。最后加入900 µL φ/75%乙醇，4℃ 10 000 rpm离心5 min。弃上清，用枪头吸出残留液体，置于超净工作台中使沉淀风干，加入30 µL无RNase ddH₂O溶解RNA。

cDNA合成参考HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒方法。在PCR管中加入4 μL RNA、4 μL 4 × gDNA wiper Mix和8 μL RNase ddH₂O，轻轻混匀，42℃反应2 min，置于冰上，加入4 μL 5 × HiScript III qRT SuperMix，轻轻混匀，37℃ 15 min，85℃ 5 s反应，获得cDNA，并置于−20℃保存备用。

根据本实验室前期海雀稗全长转录组结果，筛选得到PvMYB1基因全长序列。PvMYB1基因全长片段由生工生物工程（上海）股份有限公司连接到pUC-SP载体后，对其进行测序分析，确认PvMYB1序列。

利用Expasy（https://web.expasy.org/）对PvMYB1进行蛋白理化性质分析，在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）中对蛋白保守结构域进行分析；借助 SignalP 5.0在线分析平台（https://novopro.cn/tools/signalp），完成PvMYB1蛋白信号肽预测，通过WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）预测亚细胞定位；采用MEGA 11软件构建蛋白进化树。

参考刘莉婷等^[22]方法，采用 QuantStiduoTM Real-Time PCR仪器（Thermo Fisher，美国）进行实时荧光定量分析。20 μL 反应体系含：10 μL ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，中国）、6 μL ddH₂O、上下游引物各1 μL及被30倍稀释的cDNA模板。95 °C预变性 10 min；随后进行40个循环的扩增，每个循环包括 95 °C变性15 s、58 °C退火30 s、72 °C延伸30 s；循环结束后，于 95 °C 保持15 s 采集终末信号，随后进行熔解曲线分析。基于PvMYB1基因表达量与看家基因PvEF1α表达量的比值计算相对表达水平^[23]。qPCR引物信息详见表1。

通过Excel与 SPSS 20.0软件完成数据处理与统计分析工作。

本研究分析了海雀稗根系受不同NaCl浓度胁迫的影响。从图1-A可以看出，盐胁迫抑制了海雀稗根系生长，NaCl处理浓度越高，根系生长受抑制程度越大。相对对照（0 g·L⁻¹）处理，15、30 g·L⁻¹NaCl处理下海雀稗总根长被显著抑制。（图1-B～D）。

Figure 1.  Effects of different NaCl treatments on root growth of Paspalum vaginatum

从图2-A、B可以看出，不同浓度NaCl处理不仅造成了地上部差异，同时也抑制了海雀稗根部干质量。相对对照（0 g·L⁻¹）处理，15、30 g·L⁻¹NaCl处理下海雀稗根部干质量被抑制了5.0%、23.7%，海雀稗地上部干质量被抑制了23.1%、35.9%。结果表明，随着NaCl浓度的升高，海雀稗的生长被抑制的程度有越来越严重的趋势。

Figure 2.  Dry weight of Paspalum vaginatum under different NaCl treatments

本研究通过PCR方法，通过PvMYB1-pYES2质粒扩增出PvMYB1基因（图3）。经PCR产物测序分析，PvMYB1基因包含1098 bp核苷酸序列，编码365个氨基酸残基。该蛋白分子量大小为39.3 kDa，理论等电点（pI）5.7，属于亲水性蛋白。

Figure 3.  Cloning of PvMYB1 gene

通过NCBI Conserved Domains数据库分析，蛋白质结构域（图4）预测显示PvMYB1蛋白N端具备两个保守SANT结构域，属于MYB转录因子R2R3亚家族。其中第一个SANT域（14～63位）含50个氨基酸残基，第二个SANT域（17～61位）由45个氨基酸残基组成。经WoLF PSORT预测，该蛋白定位于细胞核。

Figure 4.  Analysis of conserved domains of PvMYB1

为分析PvMYB1蛋白与不同物种MYB蛋白的关系，本研究将PvMYB1与水稻、玉米、大豆、小麦、拟南芥等MYB蛋白构建进化树。基于图5系统发育分析，多种植物MYB蛋白聚类为5组。PvMYB1与水稻OsMYB4同源性较高，被分在第一组中。表明PvMYB1可能具有与OsMYB4相似的增加植物对干旱胁迫的生理生化适应性的功能。

Figure 5.  Phylogenetic analysis of MYB proteins

本研究通过定量PCR的方法分析了PvMYB1基因在海雀稗不同组织中的表达情况。如图6所示，PvMYB1在海雀稗根、茎和叶中均有所表达，且PvMYB1在叶和茎中的表达量显著高于在根中的表达量。

Figure 6.  Expression analysis of PvMYB1 in different tissues

图7显示，PvMYB1基因在NaCl浓度升至15 g·L⁻¹时，在根和叶中的表达量显著上调。然而，随着NaCl浓度进一步增至30 g·L⁻¹，表达量又显著下降。15 g·L⁻¹盐处理条件下PvMYB1基因在根和叶中的表达量与对照和30 g·L⁻¹盐处理组之间差异达显著水平。PvMYB1对盐胁迫呈先升后降的表达模式，其可能在15 g·L⁻¹ NaCl范围内发挥早期应答作用。

Figure 7.  Expression analysis of PvMYB1 at different salt concentration treatments

如图8所示，与0 d相比，NaCl处理5 d和10 d的PvMYB1基因表达量在海雀稗的根和叶中都显著上升。但是NaCl处理5 d的海雀稗的根和叶中的PvMYB1基因表达量与NaCl处理10 d的PvMYB1基因表达量无显著差异。

Figure 8.  Expression analysis of PvMYB1 at different time treatment in 30 g·L⁻¹ NaC

自然环境恶化、不良的灌溉方式和气候变化加剧了土壤盐碱化问题。高盐环境胁迫下，土壤中过量可溶性盐分对多数植物是有不利影响的^[24]。种植耐盐植物可以提高盐碱地的利用率，但是由于耐盐性差，包括紫花苜蓿（Medicago sativa）在内的传统牧草植物的产量和质量受到盐胁迫的影响^[25]。海雀作为优良的草坪草、牧草和盐碱地改良草种，在对海雀稗、杂交狗牙根（Cynodon dactylon × C. transvaalensis）、结缕草（Zoysia japonica）、假俭草（Eremochloa ophiuroides）等草坪草的耐盐性分析中发现，海雀稗在盐胁迫下表现出更好的生长性能，表现为盐处理下生长被抑制的程度较小以及较高的草坪质量^[26]。同一草种中不同品种或品系的耐盐性有明显差异，因此对海雀稗种质资源进行耐盐性评价，从中筛选出了极端耐盐种‘USA17-18’^[17]。本研究中以‘USA17-18’海雀稗为实验材料，为了更好地探究海雀稗耐盐机制，本研究克隆了海雀稗 PvMYB1基因，并对其进行生物信息学及基因表达分析。

MYB转录因子广泛分布于植物体内，在调控植物生长发育的各个阶段中发挥着作用^[11]。MYB蛋白可以通过它们在N末端高度保守的DNA 结合结构域（DBD）来代表，该结构域也称为 MYB结构域^[27]。它在功能上与 DNA 结合和蛋白质-蛋白质相互作用相关，由1到4个不完全重复序列（R）组成。根据不完全重复的氨基酸序列（R）的数量，MYB蛋白分为4R-MYB、R1R2R3-MYB（3R）、R2R3-MYB（2R）和1R-MYB4类亚家族^[7]。其中，R2R3-MYB属于在植物中普遍存在的转录因子类型之一^[28]。多数研究表明，R2R3-MYB亚家族的基因具有MYB-DNA-binding和2个SANT结构域^[29]，通过在线工具对PvMYB1蛋白保守结构域进行分析，结果表明，PvMYB1蛋白具有2个SANT结构域、MYB-DNA结合域和稳定的PLN03091结构域等，符合MYB基因家族保守结构域特点，是典型的R2R3型MYB转录因子。

系统进化分析显示，PvMYB1蛋白与水稻OsMYB4、小麦（Triticum aestivum）TaMYB33等已知参与非生物胁迫响应的MYB蛋白亲缘关系较近，同属一个进化支（图5），提示PvMYB1可能具有类似的功能。在该组中，定位于细胞核内的TaMYB33促进了渗透压平衡和活性氧清除的能力，从而增强了转基因拟南芥的耐盐性和耐旱性^[30]。类似的，TaMYB80同样定位于细胞核上，在转基因拟南芥中过表达TaMYB80增加了植物对高温和干旱的耐受性^[31]。MYB转录因子对靶基因的转录调控通常发生在细胞核内,定位于细胞核内的ZmMYB39通过与胁迫相关基因的表达的相互作用和促进其表达增强了玉米的耐旱性^[32]。TaMYB30可以通过识别相关顺式元件直接与小麦蜡的生物合成相关的基因的启动子区域结合，并激活其表达，从而正向调控小麦蜡的生物合成^[33]。类似的，本研究中PvMYB1定位于细胞核中，PvMYB1可能参与了海雀稗响应非生物胁迫的不同的生理过程。

基因表达分析表明，盐处理增强了PvMYB1基因在根和叶中在30g·L⁻¹盐处理5 d、10 d以及15 g/L盐处理14 d条件下的表达量。研究表明，盐处理能增强拟南芥^[34]，水稻^[35]，小麦^[30]，大豆（Glycine max）^[27]、苹果（Malus Domestica）^[36]等植物MYB基因的表达。例如，过表达OsMYB6的植株表现出更高的耐旱性和耐盐性，且OsMYB6转基因植株中非生物胁迫响应基因的表达量与对照相比显著增加^[35]。类似的，过表达TaMYB32的转基因拟南芥的耐盐性得到提高^[37]。AtMYB30激活AtAOX1a表达以保持细胞氧化还原稳态，从而赋予植物耐盐性^[38]。AtMYB49可以通过调节叶片角质层的形成和维持叶片水分来提高植物的耐盐性,此外还可以增加叶片中的钙离子水平，并在盐胁迫下维持生物膜的稳定性^[39]。MYB转录因子可以介导多种途径来增强植物的耐盐性，因此推测PvMYB1可能也通过调控离子稳态、渗透平衡、氧化还原平衡参与海雀稗响应盐胁迫的过程。

本研究成功克隆了海雀稗PvMYB1基因，其编码一个R2R3-MYB型转录因子。表达分析表明，PvMYB1受盐胁迫显著诱导，尤其在中等盐浓度（15 g·L⁻¹）和胁迫早期表达上调，提示该基因在海雀稗响应盐胁迫过程中可能发挥重要的早期调控作用。