Potential fish predator analysis of crown-of-thorns starfish Acanthaster planci in the Xisha reef area using intestinal content DNA

2023 年 4 月8～26日在 23 个西沙海域站点网捕鱼类，将全部渔获置于−20 ℃冰箱暂存。待渔获运抵实验室后，根据 FishBase（http://fishbase. org/ ）的形态学特征鉴定样品的所属物种。首先从每种鱼类中选取 1 尾样品，取米粒大的肌肉组织样置于含有 500 mL DNA lysis buffer（ 10 mmol·L⁻¹ Tris-HCl pH 8.0 ，0.5% SDS ，100 mmol·L⁻¹ EDTA ，200 µg·mL⁻¹ Protease K）的离心管中，−80 ℃冰箱中保存至 DNA 提取，用于进一步的样品鉴定。 然后对每个站点中的每种鱼类随机挑选 3 尾（不足 3 尾时取全部），参考 Kroon 等^[11]的方法取样肠道内容物，即解剖鱼体后取出肠道，在前端剪取 1～3 cm 长的肠道，置于装有2 mL DNA lysis buffer 的离心管中，−80 ℃保存，用于后续的 DNA 提取。

采用 18S 分子标签进一步鉴定鱼类物种。首先，取出冻存的肌肉样品，解冻后依次加入 500 μL 裂解液（10 mmol·L⁻¹ TrisHCl（pH=8.0）, 10 mmol·L⁻¹ EDTA（pH=8.0）, 10 mmol·L⁻¹ NaCl, 1% 2-巯基乙醇，10 μL 蛋白酶k（10 mg·mL⁻¹ ）、65 μL 的 10%SDS），56 ℃温浴 1 h ，每隔 15 min 颠倒摇动数次，使样品充分裂解。室温下 8 000 g 离心 3 min ，吸取 500 μL 上清液，加入500 μL的v_苯酚∶v_氯仿∶v_异戊醇=25∶24∶1混合液。颠倒混匀后，室温13 000 g 离心 10 min ，吸取400 μL 上清液，加入400 μL的v_氯仿∶v_异戊醇=24∶1混合液。再次颠倒混匀后，室温13 000 g 离心 10 min ，吸取 200 μL上清液至新的离心管中，加入 400 μL无水乙醇。混匀后静置15 min ，室温3 000 g 离心 10 min ，倒去上清液，加入 1 mL 70%乙醇。室温13 000 g 离心 5 min ，倒去上清液后，室温干燥15 min 。最后加入 100 μLTE 溶解 DNA 沉淀，用于后续的 PCR 实验。

以提取的肌肉组织DNA 为模板，采用18S 通用引物对（ F ： 5'_-GCCAGTAGTCATATGCTTGTCT-3' ；R：5'-GGAGCTGGAATTACCGC-3'）PCR 扩增 18S 分 子标签序列。扩增体系：2.5 μL 10×PCR Buffer ，2 μL dNTP（各 2.5 mmol·L⁻¹），1 μL 引物 F（10 μmol·L⁻¹），1 μL 引物R（10 μmol·L⁻¹），1 μL DNA 模板，0.15 μL rTaq，17.35 μL DEPC 水。扩增条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s ，55 ℃ 30 s ，72 ℃ 30 s ，35 个循环；72 ℃ 10 min ，4 ℃保存。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳确定为特异性扩增后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行核酸测序。将获得的 18S 序列（表2）比对至NCBI 的 nt 数据库，根据序列同源性进一步确定样品的所属物种^[21]。

采用 CTAB 法提取鱼类肠道内容物中的总DNA^[22] .通过琼脂糖凝胶电泳法和 Nanodrop 微量分光光度计分别检测鱼类肠道内容物总DNA的质量和浓度。使用长棘海星 COTS-mtCOI 片段的特异性扩增引物对（F：5'-TCCGACTACCCGGACGCCTATAC-3' ；R：5'- AGTGGTTCGCTGGGAAGTGAAGG-3'），以鱼类肠道内容物总 DNA作为模板，进行 PCR 扩增。扩增体系：2.5 μL 10×PCR Buffer 、2 μL dNTP（各 2.5 mmol·L⁻¹）、1 μL 引物 F（ 10 μmol·L⁻¹）、1 μL 引物R（10 μmol·L⁻¹）、1 μL DNA 模板、0.15 μL rTaq，17.35 μL DEPC 水。扩增条件 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 10 min ，4 ℃保存。同时，提取长棘海星腕中部皮下肌肉的 DNA 并扩增 COTS-mtCOI 基因片段作为阳性对照组。

根据18S 分子标签序列和邻接法 （Neighbor joining），采用MEGA5.0 软件构建鱼类物种的分子系统进化树, 并经 1 000 次重复抽样（Bootstraps）检测其置信度。计算每种鱼类肠道内容物样品中的CoTS-mtCOI 基因片段检出率，并采用 Origin8.0 软件绘制圆锥图。采用卡方检验分析不同鱼类肠道内容物中 CoTS-mtCOI 基因片段检出率的差异。以P<0.05 代表差异具有统计学意义。

CoTS-mtCOI 基因片段检出率=CoTS-mtCOI 检出次数/检测样品总数

鉴定结果表明，所获鱼类隶属于 1 纲 9 目 24 科 37 属 42 种（表2）。形态学与 18S 分子标签二种方法鉴定出的鱼类物种基本一致，仅有一种经形态学鉴定为黑背圆颌针鱼（Tylosurus melanotus），而经18S 鉴定为鳄形圆颌针鱼 （Tylosurus crocodilus）。根据已有研究^[23] 分析，黑背圆颌针鱼为鳄形圆颌针鱼的亚种，本研究将此鱼归为鳄形圆颌针鱼。在所有捕获鱼类中，细鳞圆鲹（Decapterusmacarellus）渔 获 数量 最多，且在大部分站点均有捕 获；最少的种类为犬牙锥齿鲷（ Pentapodus caninus），仅在华光礁捕获 1 条。

本研究通过从鱼肠道内容物总 DNA 中 PCR 扩增 CoTS-mtCOI 基因片段来鉴定西沙礁区长棘海星的潜在鱼类捕食者。在无模板对照和单引物对照中，未见明显条带，在阳性对 照中检测到单一条带，表明 CoTS-mtCOI 基因片段的特异性扩增。进一步检测发现，在 6 种鱼类的肠道内容物 DNA 中存在 CoTS-mtCOI 基因片段的阳性扩增，分别是珠蝴蝶鱼（C. kleinii）、三间火箭（ C. rostratus ）、弓月蝴蝶鱼（ C. lunulatus）、红裸颊鲷（L. haematopterus）、东方尖唇鱼（O. orientalis）和蜂巢石斑鱼（E. merra）。

这 6 种鱼主要采集于西沙洲、石岛、晋卿岛和金银岛附近礁区。其中，珠蝴蝶鱼采集 于西沙洲附近礁区；三间火箭采集于西沙洲、石岛、晋卿岛、金银岛和石屿附近礁区；弓 月蝴蝶鱼采集于晋卿岛和琛航岛附近礁区；红裸颊鲷采集于北礁、石岛、晋卿岛、金银岛 华光礁、浪花礁、北边廊和石屿附近礁区；东方尖唇鱼采自西沙洲附近海域；蜂巢石斑鱼 源自于西沙洲、西波滩和金银岛附近礁区。

Figure 1.  CoTS-mtCOI gene fragment amplification in total DNA of intestinal contents in six fish species and agarose gel electrophoresis

在珠蝴蝶鱼、弓月蝴蝶鱼的肠道内容物 DNA 中均检测到 CoTS-mtCOI 基因片段。三间火箭和弓月蝴蝶鱼的 CoTS-mtCOI 基因片段检出率在各个站点均大于 50%，而蜂巢石斑鱼和红裸颊鲷的检出率较低分别为 33.4%和 50%（图2）。在西沙洲，珠蝴蝶鱼的检出率 显著高于蜂巢石斑鱼（P＜0.05）（图3）。在石岛、晋卿岛和金银岛，这些鱼类的检出率之间无显著差异。

Figure 2.  The detection rate of the CoTS-mtCOI gene fragment in the intestinal contents of six fish species at four sites

Figure 3.  Detection rate analysis of CoTS-mtCOI gene fragment in fish intestinal contents at Xishazhou site.

根据 42 种捕获鱼类的 18S 基因片段序列，利用邻接法构建系统发育树（图4）。在该 进化树中，所有的同科鱼类均能汇聚为一支，如蝴蝶鱼科、飞鱼科、鰺科、羊鱼科和鲭科等。珠蝴蝶鱼、三间火箭与弓月蝴蝶鱼先聚到蝴蝶鱼科亚支，再归于刺尾鱼目分支。红裸颊鲷、东方尖唇鱼与蜂巢石斑鱼最终聚到鲈形目分支。

Figure 4.  Molecular phylogenetic trees of 42 fish from Xisha island based on 18S gene fragment sequences constructed using Neighbor-Joining method

长棘海星群体暴发已导致珊瑚礁的生态系统退化及生物多样性下降，鱼类捕食者可 控制长棘海星群体数量从而降低长棘海星群体暴发频率及破坏程度^[24]。因此，查明长棘海星的鱼类捕食者对珊瑚礁生态系统的保护很重要。本研究选择正遭受长棘海星暴发的西沙群岛礁区调查长棘海星的潜在鱼类捕食者物种及其摄食能力，以期更好地防控南海长棘海星暴发进而保护珊瑚礁生态系统。

至今已发现的长棘海星捕食者种类已达到132种，包括珊瑚礁鱼类和底栖无脊椎动物等^{[11,14,25 − 27]} ，它们可摄食长棘海星配子、幼虫、幼体（亚成体）或成体^[14]。本研究首先结合形态学与18S 分子标签鉴定了网捕礁栖鱼类的种类，然后采用长棘海星特异性引物检 测了鱼类肠道内容物中的 COTS-mtCOI 基因片段，以此来鉴别中国南海西沙岛礁中的长棘海星鱼类捕食者。在珠蝴蝶鱼、三间火箭、弓月蝴蝶鱼、红裸颊鲷、东方尖唇鱼和蜂巢石 斑鱼等 6 种鱼的肠道内容物中均检测到 COTS-mtCOI 基因片段，表明它们具有长棘海星捕食能力。珠蝴蝶鱼、三间火箭和弓月蝴蝶鱼同隶属于蝴蝶鱼科，红裸颊鲷隶属于裸颊鲷科，东方尖唇鱼隶属于隆头鱼科，蜂巢石斑鱼隶属于石斑鱼科。

已有研究表明，蝴蝶鱼科鱼类能摄食长棘海星成体、配子或幼虫^{[28 − 30]} ，如丝蝴蝶鱼 （Chaetodon auriga） 、胡麻斑蝴蝶鱼（Chaetodon citrinellus）和斜纹蝴蝶鱼（Chaetodon vagabundus）喜捕食受伤和濒死的长棘海星成体^{[31 − 36]}。在本研究中，西沙礁区珠蝴蝶鱼和弓月蝴蝶鱼肠道内容物DNA中CoTS-mtCOI 基因片段的检出率为100%，三间火箭肠道内容物 DNA 中检出率均 66% 以上 。前两者的摄食能力明显高于已报导的叉纹蝴蝶鱼（Chaetodon auripes）^{[35 − 37]} ，这表明珠蝴蝶鱼和弓月蝴蝶鱼可能具有长棘海星摄食偏好性。三间火箭的摄食能力低于珠蝴蝶鱼和弓月蝴蝶鱼，这种差异可能源自它们的食性差异。珠 蝴蝶鱼是杂食性鱼类，弓月蝴蝶鱼是珊瑚虫食性鱼类，三间火箭是利用延长的管状吻在珊瑚礁区进行捕食的肉食性鱼类^{[38 − 40]} 。由此可见，尽管蝴蝶鱼科鱼类能摄食不同生长阶段的长棘海星，但其摄食方式和能力存在明显差异。

本研究在西沙礁区红裸颊鲷、东方尖唇鱼和蜂巢石斑鱼肠道内容物 DNA中的 COTS- mtCOI 基因片段检出率均≥50%。红裸颊鲷、东方尖唇鱼和蜂巢石斑鱼三者都是典型的礁区肉食性鱼类，同科的鱼类均已发现具有长棘海星摄食能力 。如太平洋裸颊鲷（Lethrinus atkinsoni ）、长吻裸颊鲷（Lethrinu miniatus）、星斑裸颊鲷（Lethrinus nebulosus）三种裸颊鲷科鱼类对长棘海星幼 体 和 成 体 的 摄 食^[26,31,41]； 横 带 唇 鱼（ Cheilinus fasciatus ） 、 波 纹 唇 鱼（ Cheilinus undulatus）和黑尾海猪鱼（Halichoeres melanurus）等隆头鱼科鱼类对长棘海星成体的摄食^{[42 − 44]}；鞍带石斑鱼对长棘海星幼体的摄食^[45] 。这些研究多是通过室内模拟观察到，且未评估鱼类的长棘海星摄食能力。

本研究首次在中国南海西沙礁区发现 6 种长棘海星潜在鱼类捕食者，包括珠蝴蝶鱼、三间火箭、弓月蝴蝶鱼、红裸颊鲷、东方尖唇鱼和蜂巢石斑鱼。这 6 种鱼类的平均摄食水≥50%，其中珠蝴蝶鱼和弓月蝴蝶鱼可能对长棘海星具有摄食偏好性。后续研究应着眼于解析捕食者的捕食效率及其对长棘海星种群的调控机制，为制定预防中国南海长棘海星暴发的策略提供重要科学指导。