Cloning, bioinformatics analysis and expression pattern of oil body protein gene in Camellia drupifera Lour.

海南大学儋州校区的油茶育苗圃（19°30'28" N, 109°29'45" E），不同成熟期果实采摘时间分别为8月（S1）、9月（S2）和10月（S3）。挑选生长状况优良的油茶植株，取其果仁作为提取RNA的样本。采用FOREGENE的多糖多酚RNA提取试剂盒（RE-05011）对相应样品进行RNA的提取，而剩余的材料在液氮中冷冻，并在−80℃下储存。提取的样品RNA经Nanodrop Lite核酸测定仪（Thermo Scientific, USA）检测浓度，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质量，合格后使用NOVA的逆转录试剂盒（NV120302S）进行反转录构建所需的CDNA文库，后续用于越南油茶OLE基因家族的扩增和实时荧光定量PCR。

根据课题组已有的越南油茶成熟期果仁组织转录组数据，找到Oleosin基因相关的序列信息，并通过Primer premier v5.0软件设计特异性引物（表1）。按照PrimeSTAR®系列高保真PCR酶试剂（R045A）说明书设置反应体系进行目的片段扩增。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并回收符合大小的目的条带，回收产物的连接依照TaKaRa的pMDTM19-T Vrtor Cloning Kit试剂盒（6013）的说明书进行，并选用上海唯地生物有限公司的大肠杆菌感受态细胞E. coli DH5α进行转化。

采用Snapgene对OLE基因家族基因的全长序列进行开放阅读框分析；通过NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）的Conserved Domain预测保守结构域；利用ExPASy ProtParam网站对OLE基因家族基因的分子量、等电点、氨基酸组成等理化性质进行分析；采用NCBI数据库下载不同植物的OLE的氨基酸序列；使用DNAMAN v8.0软件对越南油茶OLE基因和其他物种同源蛋白序列进行比对；使用MEGA v11软件对不同属种进行邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统进化树；采用Wolfpsort在线网站预测OLE基因的亚细胞定位；通过SOPMA在线工具进行OLE基因的蛋白质二级结构预测，并结合SWISS-MODEL在线工具预测OLE基因家族基因的蛋白质三级结构。

以越南油茶不同成熟期果仁提取RNA，并反转录成cDNA作为模板，通过Primer premier v5.0软件设计（表1）RT-qPCR引物进行扩增，使用NOVA的Taq SYBRt® Green qPCR Premix （Universal） （NV30202M）的两步法根据说明书中的反应体系和程序进行荧光定量PCR，相对表达量计算采用2^−ΔΔCt法进行数据处理，结合双尾t检验（Two-taild t-test）和IF函数判断显著性，通过Graphpad Prism v8.0绘图。

根据课题组现有的越南油茶转录组数据，设计特异性引物，并以越南油茶果仁提取RNA（图1），反转录cDNA作为模板，使用PrimeSTAR®系列高保真PCR酶扩增OLE基因家族基因，1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增的产物长度是否正确，获得CdOLE1、CdOLE2、CdOLE3、CdOLE4基因编码的CDS全长序列长度分别为447 bp、426 bp、423 bp、465 bp（图2），编码CDS的氨基酸序列长度分别为149、142、141、155。

Figure 1.  Agarose gel electrophoresis images of RNA extracted from C. drupifera kernels

Figure 2.  PCR gel electrophoresis of CdOLE1 genes in C. drupifera

通过NCBI-Conserved-Domain对OLE基因家族的氨基酸序列进行保守结构域分析。结果发现，OLE基因家族所编码的蛋白均含油体蛋白特有的保守结构域Oleosin （PF01277），并且确定为Oleosin superfamily成员，编码的残基位置分别为CdOLE1: 29～139、CdOLE2:18～130、CdOLE3: 18～129、CdOLE4: 34～145，Oleosin结构域最显著的特征是存在一个高度保守的中央疏水结构域，富含脯氨酸和疏水残基。该结构域在脂滴表面形成 β-折叠桶，直接插入油体的甘油三酯核心中，起锚定作用，调控脂代谢的不同环节（图3）。

Figure 3.  Conserved domain prediction of proteins

多序列比对和系统发育分析是进行多个同源物种进行进化关系和功能研究的重要方法。将OLE基因家族基因的蛋白序列与从NCBI下载的不同植物（马铃薯、玉米、拟南芥、山茶等）中的同源蛋白序列进行多序列比对。结果显示，越南油茶的OLE基因在大多数OLE基因中有着相对保守的Oleosin结构域（图4）。因此，表明了扩增的越南油茶OLE基因家族基因属于Oleosin家族中的成员。通过MEGA v11软件，对越南油茶、马铃薯、玉米、拟南芥、山茶、大豆和普通油茶的Oleosin基因家族成员进行了系统发育分析。结果表明，所有的基因可以被分为四个谱系（亚家族），分别为T-Oleosin、U-Oleosin、SL-Oleosin和SH-Oleosin。T-Oleosin亚家族成员仅在拟南芥和油菜这两个十字花科物种存在，越南油茶基因家族则分布在SL和SH两个亚家族。越南油茶CdOLE1和CdOLE4属于SL-Oleosin亚家族，CdOLE2和CdOLE3属于SH-Oleosin亚家族。CdOLE1与CoOLE1基因距离最近，CdOLE2、CdOLE3和CdOLE4基因均与普通油茶聚在了一簇，表明越南油茶与普通油茶同源性最高，这与群体基因组学研究结果一致，说明越南油茶与六倍体普通油茶存在强烈基因渗入^[27]。（图5）。

Figure 4.  Alignments of amino acid sequences of CdOLE1−CdOLE4 gene in C. drupifera with those in other species

Figure 5.  Phylogenetic tree analysis of amino acid sequences of CdOLE1−CdOLE4 genes in C. drupifera and other species

利用ExPASy在线工具的ProtParam tool模块对越南油茶OLE基因家族基因的蛋白质理化性质进行分析，结果所示（表2），4个基因编码的氨基酸长度分别为149、142、141、155个氨基酸。等电点分别为9.84、9.03、9.3和9.69，为碱性蛋白质。不稳定指数分别为47.23、44.36、32.32和36.34，其中CdOLE1和CdOLE2不稳定指数大于40，属于不稳定蛋白；脂肪系数分别为104.12、107.38、99.79和111.49，而亲水性指数分别为0.232、0.428、0.210和0.274，属于疏水性蛋白。通过Wolfpsort在线网站预测OLE家族基因的亚细胞定位，得出CdOLE1和CdOLE4都定位在质膜，而CdOLE2和CdOLE3则分别定位在叶绿体和液泡。

为了更好分析越南油茶OLE基因的蛋白结构组成，利用SOPMA在线工具对油茶OLE基因家族蛋白质进行二级结构分析，结果显示越南油茶CdOLE1、CdOLE2、CdOLE3和CdOLE4蛋白的结构主要由α-螺旋（alpha helix）、延伸链（extended strand）和无规则卷曲（random coil）构成，其中α-螺旋分别占比60.14%、58.82%、60.71%和59.09%；延伸链结构分别占比7.43%、10.29%、11.43%和9.09%；无规则卷曲结构占比32.43%、30.88%、27.86%和31.82%（图6）。

Figure 6.  Secondary structure prediction of CdOLE1−CdOLE4 gene

利用Expasy在线软件的SWISS-MODEL模块对越南油茶OLE基因家族蛋白质的三级结构进行在线预测，表明越南油茶Oleosin蛋白的三级结构均相似，主要空间结构是α-螺旋和无规则卷曲（图7）。

Figure 7.  Prediction of protein tertiary structure

为更好的探讨OLE基因在越南油茶中的表达模式，本研究利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术，对CdOLE1、CdOLE2、CdOLE3和CdOLE4基因在果仁不同成熟期的表达特异性进行探究。以S1时期作为对照组，数据显示（图8）CdOLE3为表达量最高的基因，其峰值出现在S2时期。其次是CdOLE1基因，在S3时期出现高表达。同时CdOLE2、CdOLE4基因均在S2时期出现较高的表达。在S3时期CdOLE1为表达量最高的基因，其次是CdOLE2、CdOLE4基因的表达量最低。通过以上数据进行分析发现，越南油茶OLE基因家族在不同成熟期表达呈现显著的时期特异性。

Figure 8.  Expression patterns of CdOLE1−CdOLE4 gene in C. drupifera at different maturation stages

本研究通过对油茶基因家族克隆及生物信息学分析，首次系统解析了越南油茶（Camellia drupifera Lour.）油体蛋白OLE基因家族的结构特征、进化关系及表达模式，揭示了其在油茶油脂合成与储存中的潜在调控功能。克隆获得CdOLE1、CdOLE2、CdOLE3和CdOLE4基因，其编码的蛋白均具有典型的Oleosin保守结构域，包含中央疏水结构域及两亲性末端，与拟南芥（Arabidopsis thaliana）的Oleosin蛋白高度同源^[28]系统发育分析表明，越南油茶OLE基因分布于SL和SH亚家族，与十字花科特有的T亚家族明显分化，这一结果支持了Huang等^{[8, 9]}提出的油体蛋白进化谱系，即T谱系可能为十字花科特有，而SL和SH谱系在木本油料植物中更为保守。越南油茶OLE基因家族表现出亚家族特异性分布，并与普通油茶形成强同源聚类，表明该基因家族在演化过程中存在功能保守与分化。其中，SH亚家族则可能维持核心脂质合成功能。

蛋白理化性质分析表明，CdOLE1和CdOLE2为不稳定性碱性疏水蛋白，其亚细胞定位分别位于质膜和叶绿体，暗示其可能通过动态膜结合调控油体稳定性。而CdOLE3和CdOLE4的高α-螺旋占比（>58%）与拟南芥OLE1类似，可能通过形成β-折叠桶结构锚定油体，限制脂滴融合并维持油体大小，从而影响油脂积累效率。值得注意的是，CdOLE4与拟南芥OLE1的同源性较高，且其过表达可能通过扩大油体粒径提高油脂含量，这与甘蓝型油菜BnaOLE1转基因拟南芥的研究结果一致^[13]。

表达模式分析表明，CdOLE3基因在果实成熟中期（S2期）显著高表达，且表达量最高。而CdOLE1基因在成熟后期（S3期）表达量最高，说明不同的越南油茶OLE基因家族成员呈现时序特异性表达特征，推测OLE基因在油茶油脂积累的不同阶段具有功能分工。在前期我们对越南油茶不同成熟期的果仁脂肪酸组成进行分析，结果表明，棕榈酸、油酸和亚油酸为脂肪酸的主要组分（占总脂肪酸96.0%），且在S1～S2时期含量高于S3时期^[29]。时序关联性观察发现，OLE2和OLE4在S2期的特异性高表达与脂肪酸合成高峰同步，提示二者编码的油体蛋白可能通过其疏水结构域锚定于内质网衍生的磷脂单层膜，促进新生油体微滴的形成与隔离，为棕榈酸、油酸等主要脂肪酸的初期储存提供物理支撑。而OLE3基因在S2的表达量显著高于其他的基因，结合其在脂肪酸合成高峰后的表达时序特征，推测提示OLE3可能作为关键的储存巩固因子。从功能机制推论，高丰度的OLE3转录本可能驱动OLE3蛋白合成，后者通过其疏水结构域嵌入油体磷脂膜，形成致密界面层以抑制脂滴融合及脂酶水解。值得注意的是，OLE1基因在S3期高表达，这种表达时序滞后于脂肪酸合成峰期的现象，推测OLE1基因的表达动态与脂肪酸合成存在功能衔接，提示该基因可能通过介导的油体蛋白加固油体膜稳定性延长脂滴保护周期。这种OLE基因的功能分工，在油料作物中高度保守，使得油脂在油料作物中高效积累。类似地，油莎豆块茎发育中，CeOLE1、CeOLE3和CeOLE5在油脂快速累积期高表达，直接驱动三酰甘油组装，而过表达CeOLE2、CeOLE5可显著提高烟草叶片含油量^[30]。在大豆中GmOLE1在低温胁迫下表达上调以保护油脂稳定性^[11]，而红花Ctoleosin的异源表达可显著提升转基因植物的含油量^[12]。油桐种子中，VfoOLE1和VfoOLE3在发育中后期高表达，其mRNA水平与油脂积累速率呈正相关，且VfoOLE1和VfoOLE3过表达显著提升转基因植物含油量^[31]。本研究进一步证实，OLE基因的时空特异性表达是调控油茶油脂合成的重要分子机制，其表达模式与油体发育及脂质积累动态密切相关。

综上，本研究不仅为解析油茶油脂代谢的分子机制提供了关键基因资源，也为利用基因编辑或过表达技术培育高油型油茶品种奠定了理论基础。未来研究可聚焦于CdOLE1和CdOLE3基因的功能验证及其与油脂合成关键酶（如DGAT、PDAT）的协同调控网络，同时结合多组学数据挖掘油茶油脂合成的全局调控因子。