Mechanism of the cell division protein kinase PlCdc15 regulates the pathogenicity of Peronophythora litchii

本研究用的荔枝霜疫霉（P. litchii）野生型菌株为Shs3菌株。试验荔枝叶片和果实品种均为妃子笑。基因编辑载体pYF515和pBS由本实验室保存。

通过NCBI的BLASTP（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）收集5个病原卵菌和5个病原真菌及模式真菌酿酒酵母中Cdc15的同源蛋白序列，并使用MEGA v10.1.7软件进行进化关系分析。5个病原卵菌分别为Phytophthora litchii、P. sojae、P. nicotianae、P. cinnamomi、P. megakarya，5个病原真菌分别为Magnaporthe oryzae、Aspergillus flavus、Fusarium graminearum、F. oxysporum、Colletotrichum graminicola，及模式真菌酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。通过SMART网站（http://smart.embl-heidelberg.de/）分别进行功能域预测分析。高级结构通过在线网站Swiss model（https://swissmodel.expasy.org/）进行分析获得。

利用在线网站EuPaGDT（http://grna.ctegd.uga.edu/batch_tagging.html）选取构建CRISPR-Cas9 载体的SgRNA序列，并将序列送至生物公司进行合成，将合成的序列通过同源重组的方式连接至pYF515载体上。每个待敲除的基因构建两个不同位点的pYF515载体以提高敲除效率；同时扩增待敲除基因的上游、下游的800～1000 bp片段及潮霉素片段，并通过同源重组的方式将其按照上游片段–潮霉素–下游片段的顺序连接至pBS载体上。将构建好的两个pYF515载体及pBS载体的质粒通过PEG介导的原生质体转化方式转入野生型菌株Shs3原生质内后过夜静置孵育，将孵育后的原生质体与含有G418（50 μg·mL⁻¹）PM培养基混匀后倒平板培养，待平板长出菌丝后再用含有G418（100 μg·mL⁻¹）PM培养基进行覆盖，继续培养至平板上长出菌落后进行转接并提取基因组进行验证，并将基因组送至生物公司进行测序。本方法中提到的生物公司均为生工生物工程股份有限公司。

将待测定菌株活化于V8固体培养基上生长至菌落直径约为3 cm时，切取菌落边缘3 mm × 3 mm的菌丝块接种于V8固体培养基上，在25 ℃恒温培养箱中黑暗培养6 d，观察菌丝状态，用十字交叉测量法测量菌株的直径并拍照记录，每个处理设置3个生物学重复。

将待测定菌株活化于V8固体培养基上生长至菌落直径约为3 cm时，切取菌落边缘3 mm × 3 mm的菌丝块接种于V8固体培养基上，在25 ℃恒温培养箱中黑暗培养6 d后收集孢子囊，制备孢子囊悬浮液，将孢子囊悬浮液定容至3 mL，吸取10 μL孢子囊悬浮液于血球计数板上计数统计，每个平板计数6次，每个供试菌株设置3个生物学重复。

将待测定菌株活化于V8固体培养基上生长至菌落直径约3 cm备用。叶片致病力选取大小叶龄及生长状态相近的新鲜‘妃子笑’嫩叶，切取上述备用菌株菌落边缘5 mm × 5 mm菌丝块接种到‘妃子笑’嫩叶上，25 ℃条件下黑暗培养36 h后观察并拍照，利用Image J软件统计病斑面积，每个供试菌株设置3个生物学重复。果实致病力则选用新鲜‘妃子笑’果实，用无菌水清洗3遍后，晾干表面水分，切取上述备用菌株菌落边缘5 mm × 5 mm菌丝块接种到果实表皮上，25 ℃条件下黑暗培养96 h后观察并拍照，将果实表皮平铺后，利用Image J软件统计发病面积，计算占发病面积比例，每个供试菌株设置3个生物学重复。

将待测定菌株活化于V8固体培养基上生长至菌落直径约为3 cm时，切取菌落边缘3 mm × 3 mm的菌丝块于V8液体培养基中震荡培养36～48 h，用无菌水清洗菌丝球表面培养基，后置于质量浓度为10 μg·mL⁻¹的DAPI染料中在黑暗条件下染色3 min，再用无菌水清洗菌丝球表面多余染料后，挑取少量菌丝于荧光显微镜下观察细胞核分布情况，每次观察50根菌丝，每个供试菌株设置3个生物学重复。

取上述孢子囊悬浮液于12 ℃条件下低温诱导1 h后，置于25 ℃条件下根据试验菌株取不同的时间点进行FM4-64染色，于荧光显微镜下观察孢子囊割裂情况，并拍照记录，每次观察100个孢子囊，每个供试菌株设置3个生物学重复。

通过同源性比对分析鉴定到了荔枝霜疫霉中Cdc15的同源蛋白PlCdc15，基因PlCDC15长度为3 940 bp，编码1 082个氨基酸。进化关系分析结果显示，Cdc15在真菌和卵菌中均高度保守存在，且真菌与卵菌之间可能存在Cdc15特异性（图1-A）。功能域预测分析结果显示，PlCdc15有一个S_TKc激酶功能域，该功能域保守地存在于病原卵菌、病原真菌及酿酒酵母中（图1-A）。进一步蛋白高级结构分析发现PlCdc15N端激酶功能域和C端尾端之间依靠线状结构相连（图1-B）。

Figure 1.  Evolutionary analysis, functional domains, and tertiary structure prediction of PlCdc15

为探究蛋白激酶PlCdc15在荔枝霜疫霉侵染寄主过程中的作用，首先通过qRT-RCR对PlCDC15在不同侵染时期的表达量进行测定。以荔枝霜疫霉孢子囊接种到寄主叶片上0 h为对照组，对荔枝霜疫霉营养生长阶段和侵染不同时期的转录水平分析结果显示，PlCDC15在孢子囊与寄主接触初期，处于低表达水平，6 h转录水平开始升高，在12 h以后转录水平显著高于营养菌丝阶段，且一直保持持续上调表达趋势，直到48 h仍处于高表达水平（图2-A）。这表明PlCdc15在荔枝霜疫霉生长发育及侵染寄主过程中处于活跃状态，为探索PlCdc15作用机制，进一步对其进行基因敲除。在本实验过程中，荔枝霜疫霉为二倍体病原卵菌且PlCDC15基因长度较长，难以获得PlCDC15基因全长的缺失突变体。结合功能域及高级结构分析，将PlCDC15在连接N端和C端的线性区域（E400）截为两段进行敲除，并利用CRISPR-Cas9技术分别对这两段进行基因敲除。对多次验证获得的ΔPlcdc15-Stk突变体三个阳性转化子再次进行PCR验证，其中，验证引物BN1为PlCDC15-Stk基因（对应的蛋白长度为第1～400个氨基端）内部的验证引物，BW1为PlCDC15-Stk基因上游和潮霉素内部的验证引物，结果显示3个转化子ΔPlcdc15-StkT138、ΔPlcdc15-StkT221、ΔPlcdc15-StkT251均为ΔPlcdc15-Stk的基因缺失突变体（图2-B）。对多次验证获得的ΔPlcdc15-Back突变体3个阳性转化子再次进行PCR验证，其中，验证引物BN2为PlCDC15-Back基因（对应的蛋白长度为第401−1082个氨基端）内部的验证引物，BW2为PlCDC15-Back基因上游和潮霉素内部的验证引物，结果显示3个转化子ΔPlcdc15-BackT86、ΔPlcdc15-BackT153、ΔPlcdc15-BackT192均为ΔPlcdc15-Stk的基因缺失突变体（图2-C）。

Figure 2.  Expression analysis of PlCDC15 (A) and validation of the ΔPlcdc15-Stk (B) and ΔPlcdc15-Back (C) mutants

野生型菌株Shs3、转化空白对照菌株EV、ΔPlcdc15-Stk突变体的3个阳性转化子菌株T138、T221、T251和ΔPlcdc15-Back突变体的3个阳性转化子菌株T86、T153、T192的营养生长速率测定结果显示，野生型菌株Shs3的平均菌落直径为6.73 cm，而ΔPlcdc15-Stk和ΔPlcdc15-Back突变体的平均菌落直径分别为2.89 cm和5.32 cm，均显著小于野生型（图3-A—B）。而孢子囊产量统计结果显示，ΔPlcdc15-Stk突变体孢子囊数量为0.18×10⁴个·cm⁻²，ΔPlcdc15-Back突变体为3.88×10⁴个·cm⁻²，野生型菌株Shs3为6.53×10⁴个·cm⁻²，显著高于2个突变体（图3-C—D）。上述结果表明，PlCdc15的N端STKc功能域和C端Back端在荔枝霜疫霉生长及产孢过程中均发挥重要作用。

Figure 3.  Measurement of vegetative growth rate and quantification of sporangia

叶片致病力结果显示，接种菌丝块于荔枝嫩叶36 h后，ΔPlcdc15-Stk突变体和ΔPlcdc15-Back突变体的病斑面积显著低于野生型菌株（图4-A）。果实致病力结果显示，ΔPlcdc15-Stk突变体和ΔPlcdc15-Back突变体接种96 h后虽然可以侵染寄主，但是与菌丝布满整个果实表面且已发育形成大量孢子囊的野生型相比，2个突变体的侵染果实的能力显著下降（图4-B），上述结果说明PlCdc15功能的正常形式对于荔枝霜疫霉的侵染寄主是必要的。

Figure 4.  Pathogenicity assay

DAPI染色结果显示，与野生型均一有序的细胞核排布相比，ΔPlcdc15-Stk突变体和ΔPlcdc15-Back突变体的细胞核密度降低，且排布紊乱（图5-A）。这说明PlCdc15的N端STKc功能域和C端Back端在荔枝霜疫霉细胞分裂过程中均发挥重要作用。荔枝霜疫霉侵染寄主过程中孢子囊割裂和卵孢子的形成尤为重要，且这些发育阶段的调控均与细胞分裂密切相关，为进一步明确PlCdc15的作用机制，通过FM4-64对低温诱导后的孢子囊染色，诱导后5 min野生型菌株已经有超过95%的孢子囊处于割裂状态，而同一阶段的ΔPlcdc15-Stk突变体和ΔPlcdc15-Back突变体的孢子囊无法进行割裂；随着时间的延迟，在30 min时ΔPlcdc15-Back突变体约63%孢子囊处于割裂状态，而ΔPlcdc15-Stk突变体仍无法进行割裂（图5-B）。并且ΔPlcdc15-Back突变体卵孢子数量显著下降而ΔPlcdc15-Stk突变体丧失了形成卵孢子的能力（图5-C），说明细胞分裂异常使得荔枝霜疫霉有性生殖无法进行。这说明PlCdc15参与调控荔枝霜疫霉细胞分裂，且在孢子囊割裂及形成卵孢子过程中发挥重要功能。

Figure 5.  DAPI staining, sporangial cleavage and oospore formation

荔枝生产及采后储运过程中病害的发生制约荔枝产业健康发展，其中荔枝霜疫病危害最为严重。荔枝霜疫霉隶属于二倍体病原卵菌，由于其寄主种植范围局限，以及其全基因组测序较晚等原因，其分子致病机制研究较为有限。随着中国对热带特色高效农业的大力扶持以及基于CRISPR-Cas9的敲除技术的发展，荔枝霜疫霉的分子致病机制开始逐渐受到相关行业和科研人员的关注。目前虽然已有相关文章报道鉴定到了荔枝霜疫霉致病相关的功能基因，但是在细胞分裂相关方面尚无相关研究报道^[17−21]。因此本研究致力于探索荔枝霜疫霉细胞分裂相关的调控机制。

荔枝霜疫霉在荔枝的生长及采后储运过程中，可以通过其营养菌丝和孢子囊侵染寄主植物，所以营养生长和孢子囊的异常将使荔枝霜疫霉侵染寄主的能力受到影响。同源性比对分析及多种生物信息学分析鉴定到了荔枝霜疫霉中Cdc15的同源蛋白PlCdc15，该蛋白在多个卵菌中都保守存在，且都拥有保守的磷酸酶功能域，提示卵菌中Cdc15可能也是通过发挥磷酸酶功能参与调控细胞分裂过程。而通过进化关系推测真菌与卵菌之间还是可能存在其特异性的。并且在侵染阶段PlCdc15的持续上调表达，说明PlCdc15可能在侵染寄主过程中发挥重要功能。本研究通过对PlCdc15的N端激酶功能域和C端区域分别进行功能分析，发现PlCdc15的N端激酶功能域和C端区域在荔枝霜疫霉中均参与调控细胞分裂过程，且其功能的正常进行对于荔枝霜疫霉的生长发育及侵染寄主的过程均至关重要。该项研究明确了PlCdc15激酶功能域及其没有明确的功能域C端对于PlCdc15功能发挥均至关重要，为病原卵菌的研究提供了科学的理论基础，可望为病原卵菌的特异性杀菌剂的研发提供潜在的靶标位点。