Resistance monitoring and voltage-gated sodium channel mutation analysis of Myzus persicae against pyrethroids in Hainan

桃蚜室内种群是由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所陈青研究员于2021年馈赠，饲养使用新鲜、未接触任何药剂的包菜叶片。室内饲养条件：温度（25 ± 2） ℃，相对湿度66%～80%，光周期L:D=16 h:8 h。桃蚜田间种群采集自2021—2023年海口市、儋州市和三亚市，具体位置见表1。饲养条件与室内种群一致，饲养一代后进行毒力测定。

桃蚜毒力测定使用叶片药膜法：使用打孔器将洗净的白菜叶打出4 cm圆形叶片，放置到一次性塑料杯（盖子具有通气孔）中，倒入30 mL药液使叶片和塑料杯浸泡15 s，随后倒回药液晾干2 h。用毛笔小心将桃蚜转移至准备好的塑料杯中，最后在盖口放上20目（孔径为0.127 mm）防虫网后盖上盖子。所用桃蚜选择由无翅雌蚜产出的4～6 d若蚜和7～11 d无翅成蚜进行实验。所用药剂为95%氯菊酯（上海克林生物科技有限公司）；98%联苯菊酯（北京华诺远生物科技有限公司）；98%溴氰菊酯（北京华诺远生物科技有限公司）；97%高效氯氟氰菊酯（上海毕得医药科技股份有限公司）。所用药液使用0.1% Triton X-100溶液等比稀释6～8个浓度，每个浓度设置3组重复，每个重复放置30头桃蚜，在温度25 ℃、相对湿度70%、光周期16 L:8 D条件下48 h后检查成蚜死亡情况，使用毛刷轻触桃蚜，无反应判定为死亡。根据统计后的总虫数和死亡数，采用PoloPlus软件进行方差分析和回归分析，得出LC₅₀、95%置信区间，斜率、自由度、卡方等。

根据NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）已上传的桃蚜钠离子通道α亚基（Genbank登录号：MN124170）和TipE（Genbank登录号：MN176135）序列，利用SnapGene软件设计PCR引物，引物设计区域在外显子上，克隆引物信息见表2。引物由擎科生物科技股份有限公司合成。

利用TransDirect^® Animal Tissue PCR Kit快速提取试剂盒（北京全式金）提取单头桃蚜基因组DNA。取单头无翅桃蚜成虫放入1.5 mL离心管进行液氮冷冻处理，加入12.0 μL的AD1 Buffer和3.0 μL的AD2 Buffer，使用研磨棒进行充分研磨。室温静置10 min后95 ℃孵育3 min。再加入12.0 μL的AD3 Buffer充分混匀，放入−20 ℃冰箱保存。

使用2×Phanta^® Flash Master Mix（Dye Plus）（南京诺唯赞）试剂盒进行PCR扩增，反应体系为9.5 μL ddH₂O，12.5 μL 2×Phanta Flash Master Mix，1.0 μL上游引物，1.0 μL下游引物，1.0 μL DNA模板。PCR反应条件为98 ℃ 1 min；98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 8 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证，条带正确后由擎科生物科技股份有限公司测序。

对海南三个地区（海口、儋州和三亚）桃蚜田间种群进行抗药性监测，桃蚜无翅成蚜对四种菊酯药剂的抗性在总体上呈现逐年上升趋势。其中海口种群（表3）对联苯菊酯抗性的增长最为显著，2021—2023年，LC₅₀从179.763 mg·L⁻¹增至2 085.829 mg·L⁻¹，抗性倍数提升11.6倍，尤其在2021—2022年间，抗性倍数从7.35增至38.93，增幅达5.30倍。海口种群对氯菊酯抗性持续上升，LC₅₀从127.432 mg·L⁻¹增至625.119 mg·L⁻¹，抗性倍数提高4.9倍。海口种群对溴氰菊酯抗性增长显著，2021—2023年，LC₅₀从89.154 mg·L⁻¹增至974.511 mg·L⁻¹，抗性倍数提高10.9倍。海口种群对高效氯氟氰菊酯的抗性呈先增后减趋势，LC₅₀最大为123.412 mg·L⁻¹。

儋州种群（表4）对联苯菊酯的抗性倍数提高了2.27倍，2021—2023年，LC₅₀从109.510 mg·L⁻¹增至297.588 mg·L⁻¹。对溴氰菊酯抗性倍数提高了1.81倍。LC₅₀从175.219 mg·L⁻¹增至317.829 mg·L⁻¹。儋州种群对氯菊酯和高效氯氟氰菊酯的抗性呈先降后升趋势，LC₅₀最大分别为256.581、194.872 mg·L⁻¹。

三亚种群（表5）对联苯菊酯、溴氰菊酯、高效氯氟氰菊酯均呈现逐年增长趋势，其中对高效氯氟氰菊酯增长最为显著，2021—2023年，LC₅₀从41.992 mg·L⁻¹增至334.303 mg·L⁻¹，抗性倍数提高了7.95倍。三亚种群对联苯菊酯抗性倍数提高了2.14倍。LC₅₀从123.168 mg·L⁻¹增至262.661 mg·L⁻¹。对溴氰菊酯抗性倍数提高了1.62倍，LC₅₀从177.431 mg·L⁻¹增至288.418 mg·L⁻¹。三亚种群的对氯菊酯抗性呈先增后减趋势，LC₅₀最大为383.059 mg·L⁻¹。

桃蚜若蚜对联苯菊酯和溴氰菊酯抗性变化趋势与成蚜一致。桃蚜若蚜对联苯菊酯和溴氰菊酯的抗性在三个地区均呈现逐年上升趋势，其中海口种群（表6）的抗性增长最为显著，2021—2023年，对联苯菊酯LC₅₀从85.034 mg·L⁻¹增至601.582 mg·L⁻¹，抗性倍数提升7.06倍；对溴氰菊酯LC₅₀从89.154 mg·L⁻¹增至974.511 mg·L⁻¹，抗性倍数提高8.98倍。海口种群对氯菊酯也呈现逐年上升趋势，LC₅₀从2021年的149.731 mg·L⁻¹增至2023年的319.846 mg·L⁻¹，抗性倍数从34.98倍增至74.73倍。海口种群对高效氯氟氰菊酯抗性倍数先增后降，LC₅₀最大为123.412 mg·L⁻¹。

儋州种群（表7）对联苯菊酯和溴氰菊酯抗性呈现逐年上升趋势，对联苯菊酯LC₅₀从2021年的69.419 mg·L⁻¹增至2023年的283.593 mg·L⁻¹，抗性倍数从3.73倍增至15.23倍；对溴氰菊酯LC₅₀从2021年的175.219 mg·L⁻¹增至2023年的317.829 mg·L⁻¹，抗性倍数从11.01倍增至19.97倍。儋州种群对氯菊酯和高效氯氟氰菊酯抗性呈现先降后升趋势，LC₅₀最大分别为216.634、194.872 mg·L⁻¹。

三亚种群（表8）对联苯菊酯、溴氰菊酯和高效氯氟氰菊酯抗性呈现逐年上升趋势，其中对高效氯氟氰菊酯抗性增长最为显著，LC₅₀从2021年的41.992 mg·L⁻¹增至2023年的334.303 mg·L⁻¹，抗性倍数从3.78倍增至30.06倍。三亚种群对氯菊酯抗性倍数先增后降，LC₅₀最大为321.030 mg·L⁻¹。

对2022年海口、儋州和三亚种群的钠离子通道DomainⅡ区域和辅助亚基TipE基因进行克隆，并与室内种群的克隆子序列进行比对。结果显示，三个田间种群在918位点和1014位点存在连锁突变现象，且不同地区种群突变频率存在显著差异。如图1所示，918和1014位点主要表现为“I-F”、“T-F”和“L-L”三种类型。“L-L”连锁突变在三个种群中均占主导地位，海口、儋州和三亚种群的突变频率分别为70%、50%和50%，表明该突变类型在田间种群中具有较高的选择优势（表9）。“T-F”连锁突变仅在三亚种群中被检测到，突变频率为10%。三个种群的钠离子通道辅助亚基TipE基因均未发生突变。

Figure 1.  Three interlock patterns at the sites 918 and 1014 from the Myzus persicae

本研究对海南省桃蚜田间种群进行三年持续的抗药性监测，发现海口、三亚和儋州三个地区的桃蚜种群对高效氯氟氰菊酯的抗性水平最低，而对联苯菊酯的抗性最高，且整体抗药性水平呈上升趋势。对比海南其他害虫对拟除虫菊酯类药剂的抗性趋势，袁琳琳等^[36]的研究结果显示海口、乐东和三亚种群的普通大蓟马对甲氰菊酯和氯菊酯的抗性也逐年增强，这与本研究监测海南省桃蚜对拟除虫菊酯类药剂的抗性趋势一致，表明海南地区害虫对拟除虫菊酯类药剂的抗性普遍呈增强态势。同时，陈青等^[37]发现海南崖城和金江两地区豇豆蚜虫种群对三氟氯氰菊酯和氰戊菊酯的抗性倍数也达到中等水平。汤秋玲等^[38]在2011—2014年共监测了中国11个省市62个桃蚜田间种群，发现这些种群对高效氯氰菊酯抗性倍数为最高472倍，对氯菊酯产生了15.3倍至123倍的中高等抗性水平，对溴氰菊酯和联苯菊酯也产生不同程度的抗性，抗药性也呈现逐年上升趋势。

从分子机制的角度来看，昆虫电压门控钠离子通道氨基酸的突变会导致昆虫对拟除虫菊酯类药剂的敏感性降低^[39]。本研究检测2022年三个桃蚜田间种群的钠离子通道Domain Ⅱ区域发现，海南三个地区两个经典氨基酸突变位点918与1014同样出现“I-F、T-F、L-L”突变连锁现象，与Wang等^[34]在桃蚜上发现的三种连锁形式一致，这个结果表明桃蚜突变连锁现象并非偶然，具有普遍性。结合2022年三个种群生测数据来看，不同突变连锁情况对菊酯类药剂有选择性抗药性。海口、儋州、三亚对联苯菊酯LC₅₀分别为951.704、135.599、126.377 mg·L⁻¹，而“L-L”连锁突变频率分别为70%、50%、50%，二者变化趋势一致。三个种群对溴氰菊酯LC₅₀分别为278.746、303.838、189.402 mg·L⁻¹，而“I-F”连锁形式突变频率分别为30%、50%、40%，二者变化趋势也一致。同样，三个种群对高效氯氟氰菊酯的抗性趋势与“T-F”连锁形式突变频率变化趋势也相同。因此，不同突变连锁形式可能会对菊酯药剂具有针对性抗性，但这一结果还需使用电生理技术进一步验证。

MacKenzie等^[40]在加拿大桃蚜种群发现I935M和I936V突变，并且电生理实验证明I936V突变能够影响钠通道的药剂敏感性^[41]。然而，本研究在海南种群中并未发现F979S、I935M和I936V等突变情况，可能是由于地理位置和对药剂的抗性倍数不同。在2022年三个桃蚜田间种群中并未TipE基因突变，原因可能是其序列具有高度保守性，Li^[42]发现昆虫TipE是一个非常保守的基因家族。使用哺乳动物β亚基和昆虫钠通道辅助亚基的序列形成的系统发育树中，桃蚜TipE与同目昆虫的TipE单独聚为一支^[43]。这些结果都表明了桃蚜辅助亚基TipE基因具有高度保守性。

综上所述，桃蚜对拟除虫菊酯类药剂的抗性发展是一个复杂的过程，涉及田间用药实践、分子机制及环境因素的多重影响。目前桃蚜对菊酯类药剂抗性呈现上升趋势，还应在防治过程中采取综合管理策略。为延缓桃蚜对拟除虫菊酯类药剂的抗性发展，在防治实践中应采取综合防治策略。首先，应避免单一药剂的频繁使用，转而采用轮换用药和混合用药的方式，以降低桃蚜对特定药剂的抗药性选择压力。目前，三个种群对高效氯氟氰菊酯抗性水平最低，其中海口种群对高效氯氟氰菊酯抗性呈下降趋势，因此建议轮换使用高效氯氟氰菊酯来控制桃蚜种群数量。其次，可结合低毒、低残留的高效农药进行防控，并通过测定桃蚜及其天敌的耐药性，筛选出对天敌影响较小但对桃蚜高效的适宜药剂浓度^[44]。此外，矿物油喷雾剂的应用也值得推广。矿物油喷雾剂通过物理作用机制（如形成油膜）可有效减少桃蚜种群数量，同时阻断病毒传播途径^[45]。在农业防治方面，轮作制度、抗性品种选育及田间卫生管理等手段可有效降低桃蚜种群基数。生物防治方面，桃蚜的天敌（如寄生蜂和瓢虫）在控制桃蚜种群中发挥了重要作用。例如，异色瓢虫和龟纹瓢虫对桃蚜具有较强的捕食能力，而菜叶蜂（俗称小菜蜂）等寄生蜂也能显著减少桃蚜种群数量^[46]。这些生物防治方法不仅对环境友好，还能实现桃蚜种群的持续控制。另外，本研究提出桃蚜“L-L”、“I-F”和“T-F”三种连锁突变形式与不同菊酯药剂的抗性水平呈现一致的变化趋势这一新的见解，可为进一步研究桃蚜对菊酯药剂抗性机制提供新的思路。