Functional analysis of MeAPX2 gene in cassava resistance to cassava common mosaic disease

实验所使用的过表达载体为pEGAD，抑制载体为pTRV1和pTRV2，蛋白表达载体为pET32a，酵母相关载体为pGBKT7、pGADT7。大肠杆菌DH5α感受态（DL1001，上海唯地），农杆菌 GV3101感受态细胞（AC1001，上海唯地），BL21（DE3）感受态细胞（CD601，TRANS）。实验材料所用木薯品种均为‘华南124’，栽培体积比例为V_营养土∶V_蛭石＝2∶1，置于海南三亚崖州独村实验室露天培养。

选取15～20 cm，有3～4个芽眼且大小基本一致的木薯茎秆放入花盆中，种植3～4周（平均温度28～32 ℃）。将生长状况一致的木薯苗叶片接种病毒，每个处理设置3个生物学重复，最后将木薯叶片进行取样，用液氮速冻，置于−80 ℃超低温冰箱保存。

根据南京建成生物工程研究所抗坏血酸过氧化物酶（APX）测试盒（A123-1-1，南京建成）对蛋白进行酶活性测定。按照说明书配置体系，最后加100 μL待测样品。将上述反应体系混匀后立即在37 ℃条件下水浴2 min，以沸水失活的蛋白为空白对照，最终在290 nm处测定数据，并计算酶活。进行3次生物学重复，并记录相关数值。酶活性定义：每mg重组蛋白每min在每mL体系中催化1 µmol·L ⁻¹底物为1个活力单位（U）。测定木薯叶片的APX酶活，将处理后的0.1 g叶片置于研钵中，加入缓冲液0.9 mL，冰水浴匀浆，离心后取上清，视作蛋白重复上述操作。

根据CTAB粗提取法提取木薯叶片RNA^[22]，再参照试剂盒（11151ES10，YEASEN）反转录成cDNA。

根据 Phytozome数据库中木薯MeAPX2 基因的序列信息，设计全长扩增引物MeAPX2-F（ATGCCGAAGAACTACCCAAAA）和MeAPX2-R（TTACGCCTCAGCAAATCCGA）。以木薯cDNA为模板，扩增MeAPX2的编码区（Coding sequences, CDS），凝胶电泳检测扩增产物。将PCR产物利用胶回收试剂盒回收，连接到所需载体上构建MeAPX2相关载体，进行后续实验。

根据序列目的基因设计荧光定量PCR引物（qMeAPXs-F/R），RT-qPCR反应为15 μL，包括：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ Fast qPCR（2×）为7.5 μL，正反引物各0.3 μL，cDNA模板2 μL，ddH₂O 4.9 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循环48次。以木薯MeEF1a为内参基因，用2^−ΔΔCt 法计算MeAPXs基因相对转录水平表达量。

将构建好的pEGAD-MeAPX2和pTRV2-MeAPX2质粒转入根癌农杆菌GV3101菌株中并注射木薯叶片。提取对照组与实验组叶片RNA并反转录成cDNA作为模板，以木薯MeEF1a为内参基因，采用RT-qPCR的方法分析MeAPX2在植株中的相对表达情况^[23]，确定过表达和抑制植株是否构建成功。

将酵母表达质粒pGBKT7-A、pGADT7-B转化到酵母AH109菌株的感受态中，并分别涂在SD/-Leu-Trp（630417，Clontech）和SD/-Leu-Trp-His-Ade（630428，Clontech）的平板上，于28 ℃条件下培养。分别挑取SD/-Leu-Trp-His-Ade平板上的酵母单菌落至SD/-Leu-Trp培养液中培养，当菌液OD₆₀₀达到1时，提取酵母质粒并进行PCR验证。将验证正确的单菌落在超净工作台中梯度稀释并点板至SD/-Leu-Trp和SD/-Leu-Trp-His-Ade板培养基上，28 ℃条件培养4 d后，进行拍照记录^[24]。

将目的片段通过同源连接连接到pET32a载体上并测序验证。验证成功后将质粒转入DE3菌株中，选取阳性克隆，采用LB培养液培育，当OD₆₀₀=0.6，加入IPTG后继续培养6 h，收集菌体、破碎，离心后上清即所需蛋白^[25]。

将目的蛋白、A/G磁珠（L00277，GenScript）、抗体混合于离心管中孵育过夜。用PBS缓冲液洗涤混合物，以除去未结合到磁珠上的蛋白。加入上样缓冲液后，将离心管于沸水中煮5 min，最后通过蛋白质印迹检测蛋白质^[26]。

本研究中所有数据均来自3个生物学重复，生物学重复的样品均来自多个植株叶片。不同字母代表样本间存在显著性差异，P<0.05。用Graphpad对数据进行处理，用SPSS、Figdraw（https://www.figdraw.com/static/index.html）进行绘图。

为探究木薯中APX酶活在木薯普通花叶病毒侵染过程中的变化，收集并测定病毒侵染后不同时间点（侵染后0、3、6、9、12、24 h， hpi）的木薯叶片的APX酶活，发现APX酶活在3 hpi时有所增加，而随着侵染时间的延长，其活性逐步下降（图1），说明CsCMV的侵染会影响木薯体内APX酶活性。

Figure 1.  APX activity in cassava during CsCMV infection

在病毒侵染过程，APX酶活发生改变，推测MeAPXs的转录水平可能也发生改变。经检测木薯体内MeAPXs的表达量发现，随着侵染时间的增加，只有MeAPX2表达量逐渐下降，而MeAPX家族的其他成员（MeAPX1和MeAPX3）的表达量无显著变化（图2）。结果表明，MeAPX2能够响应CsCMV的侵染，并且可能参与木薯的免疫应答反应，因此选其作为后续研究对象。

Figure 2.  The relative transcript level of MeAPXs in response to CsCMV infection

为了探究MeAPX2的生物学功能，首先构建其抑制植株。RT-qPCR结果表明，MeAPX2在MeAPX2-RNAi植株中的转录水平显著低于对照组，抑制率达到40%以上（图3）。而其同家族的MeAPX1和MeAPX3在MeAPX2-RNAi植株中的转录水平相较于对照组无显著变化（图3），说明成功构建MeAPX2-RNAi植株。

Figure 3.  Expression level of MeAPXs in the MeAPX2-RNAi plants

为了研究MeAPX2 是否参与调节木薯对CsCMV的免疫反应，在MeAPX2-RNAi和CK叶片中分别注射木薯普通花叶病毒的侵染性克隆，并选取不同侵染时间点（侵染后0、7、14 d， dpi）样品RT-qPCR分析RdRp和TGB1的相对转录水平。结果发现，MeAPX2-RNAi植株中的RdRp和TGB1 表达量在7、14 dpi时均显著高于CK，是CK的1.5倍（图4）。同时，MeAPX2-RNAi植株中APX酶活在7、14 dpi时均显著低于CK（图4）。观察表型发现，MeAPX2-RNAi植株整体萎蔫程度比CK组更明显，顶端叶片会更黄且叶片卷曲变形严重（图5）。这些结果表明MeAPX2正调控木薯对CsCMV的免疫反应。

Figure 4.  The accumulation of virus and APX enzyme activity in the MeAPX2-RNAi plants

Figure 5.  Phenotype of MeAPX2-RNAi plants infected with CsCMV

为了进一步探究MeAPX2在病毒中的靶蛋白，点对点分析其与CsCMV编码的蛋白互作情况。分别构建RdRp-pGBKT7、TGB1-pGBKT7、TGB2-pGBKT7、TGB3-pGBKT7、CP-pGBKT7质粒并与MeAPX2-pGADT7分别进行酵母点对点实验，结果发现，只有共转MeAPX2-pGADT7与CP-pGBKT7组合在SD/-Leu-Trp-His-Ade培养基长出了酵母单菌落，而共转MeAPX2-pGADT7与RdRp-pGBKT7、TGB1-pGBKT7、TGB2-pGBKT7、TGB3-pGBKT7组合则不能在SD/-Leu-Trp-His-Ade培养基生长（图6-A），说明MeAPX2与CP在酵母体内互作。为了进一步验证MeAPX2 与CP之间的相互作用，构建MeAPX2-pET32a、CP-pET32a表达载体，进行Pull-down试验发现，MeAPX2在Input和IP组均可以通过Myc抗体检测出条带，而GFP只能在Input组检测出条带，IP组则无法检测出对应条带（图6-B），结果表明MeAPX2与CP可直接发生互作。

Figure 6.  Interaction of MeAPX2 and CP

为了进一步探究MeAPX2与CP互作的生物学功能，分析其对MeAPX2的体外酶活的影响。在50 μL体系中，保持MeAPX2总蛋白质量浓度不变，随着CP蛋白质量浓度的增加，MeAPX2的酶活逐渐下降；而对照组GFP蛋白质量浓度 增加却未改变MeAPX2的酶活（图7）。实验结果表明，CP蛋白会体外抑制MeAPX2的酶活。

Figure 7.  CP inhibited the enzyme activity of MeAPX2 in vitro

为了进一步分析CP与MeAPX2互作的体内生物学功能，构建MeAPX2 过表达植株并RT-qPCR分析其表达量，结果表明，MeAPX2在MeAPX2-OE植株中的转录水平显著高于对照组，为对照组的20倍以上（图8）。而MeAPX1和MeAPX3在MeAPX2-OE中的转录水平与对照组相比较，无显著变化（图8），说明已成功构建MeAPX2-OE植株。

Figure 8.  The transcript level in the MeAPXs at MeAPX2-OE plants

在MeAPX2-OE和对照植株中分别喷施等量CP和GFP蛋白后，接种CsCMV并统计病毒积累量发现，外源喷施CP蛋白植株的RdRp和TGB1 转录水平在7、14 dpi时均显著高于对照组（图9）。同时，外源喷施CP组的APX酶活在7、14 dpi时均显著低于对照组（图9）。观察接种CsCMV 14 dpi的表型发现，喷施CP蛋白的植株顶端叶片卷曲且更黄，而外源施加GFP蛋白组的植株为叶片黄化（图10）。结果表明，CP抑制MeAPX2 介导的免疫反应。

Figure 9.  The accumulation of virus and APX enzyme activity in the MeAPX2-OE plants

Figure 10.  Effects of CP on MeAPX2-OE plant phenotypes

研究表明，植物病毒侵染宿主时，会严重影响植物自身代谢和生长发育，可导致活性氧相关的过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性增加，这两种酶会平衡植物组织中活性氧的积累以应对病原体的侵染^[27]。APX作为植物体内参与免疫反应的重要过氧化物酶，也可能参与了宿主对病毒的免疫应答。本研究发现，在CsCMV侵染下，APX酶活先上升再下降。在逆境条件下，植物的抗性与其体内APX基因的表达以及酶活性水平具有密切关系^[28]。同时有研究表明，APX基因家族成员转录水平的快速应答会维持细胞质中高的APX活性，抵御逆境最初侵染时导致细胞膜质过氧化^[29]，以保护细胞成分免受ROS诱导的应激氧化损伤^[30]。综上所述，APX在植物抵御逆境胁迫时发挥着重要的作用。最初APX活性升高，可维持较高的抗逆性，而后病毒的复制逐渐抑制MeAPX2的表达和APX活性，细胞内动态平衡被破坏，免疫防线逐渐削弱，病毒侵染程度逐渐加重。

为了成功侵染宿主，病毒始终与宿主免疫系统持续地发生“军备竞赛”。在病毒与宿主植物相互作用的过程中，特定病毒蛋白与寄主蛋白直接相互作用发挥着重要作用。而不同病毒的编码蛋白破坏宿主免疫系统的途径和靶蛋白存在差异。在小麦中，小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus, WYMV）编码的P1蛋白通过干扰钙调蛋白相关的免疫防御，从而促进其在小麦中的侵染^[31]。而在本实验中，通过酵母点对点验证和Pull-down实验，证实MeAPX2靶向木薯花叶病毒的编码蛋白CP，且其酶活性被CP抑制。研究结果将为深入解析CsCMV与木薯间的攻防机制提供新线索和木薯抗病分子育种提供候选基因。

随着木薯在世界粮食作物及经济作物的地位逐渐提高，CMD作为木薯重要病毒病之一，严重影响了木薯生产^[32−33]。根据王国芬等^[8]的调查结果，CsCMV检出率为36.5%，表明该病毒在我国主要木薯栽培区已有较广分布，应予以重视并持续开展相关研究。在番茄^[34]、拟南芥^[35]、苹果^[36]和水稻^[37]等植物的研究结果表明，APX相关基因表达或酶活变化与植物逆境耐受密切相关；但MeAPX2在木薯抗普通花叶病毒病中的功能尚缺乏系统研究，因此，开展其生物学功能及作用机制研究具有重要意义。同时，研究表明APXs参与多种逆境胁迫，这为后续探究MeAPX2是否参与木薯的其他胁迫反应提供了研究基础，有助于培育广谱抗性木薯优异种质。

本研究首先确定MeAPX2 是木薯抗CsCMV的正向调节因子，并阐明其发挥作用的分子机制。木薯遭受CsCMV侵染时，MeAPX2 的表达被显著抑制，同时APX酶活降低，表明MeAPX2在木薯免疫系统对抗CsCMV中发挥重要作用。通过酵母双杂交及Pull-down实验证实MeAPX2会靶向结合CsCMV编码蛋白CP，抑制植株体内APX酶活，破坏木薯免疫系统，成功侵染宿主。