Cloning, bioinformatics analysis and expression pattern of CdMYC2 gene in Camellia drupifera Lour.

越南油茶样本采集自海南大学儋州校区的油茶育苗圃（19°30'28"N, 109°29'45"E），不同成熟期果实采摘时间分别为8月、9月和10月。挑选生长状况优良的油茶植株，取其根、茎、叶和花部分作为提取RNA的样本。采用天根多糖多酚RNA提取试剂盒（RT411）对相应样品进行RNA的提取，而剩余的材料在液氮中冷冻，并在−80 °C下储存。提取的样品RNA经Nanodrop Lite核酸测定仪（Thermo Scientific, USA）检测浓度和1%琼脂糖凝胶电泳检测质量，合格后按照MonScript™RTIII All in One Mix with dsDNase试剂盒（MR05101）进行反转录获得第一链cDNA，然后-20℃保存。后续用于CdMYC2基因的扩增和实时荧光定量PCR。

根据课题组已有的转录组数据，找到CdMYC2基因相关的序列，并使用Primer premier 5软件设计特异性引物（表1）。按照 PrimeSTAR^®系列高保真 PCR 酶试剂（R045A）说明书设置反应体系进行扩增目的片段。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并回收符合大小的目的条带，回收产物的连接和转化依照pBM16A Toposmart克隆试剂盒（CL071-01）和大肠杆菌DH5α感受态细胞（DF1001）说明书进行。

采用Open Reading Frame Finder对CdMYC2的全长序列进行开放阅读框分析；通过NCBI-Conserved Domain 预测CdMYC2的保守结构域；采用NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）数据库下载不同植物的MYC2氨基酸序列；使用DNAMAN 8.0 软件对CdMYC2和其他物种同源蛋白序列进行比对；采用MEGA11邻接法构建系统进化树，重复次数为1 000；利用ExPASy - ProtParam tool在线分析CdMYC2编码的蛋白质的理化性质；利用SignalP - 3.0在线软件预测CdMYC2蛋白信号肽；通过TMHMM v2.0分析CdMYC2的跨膜结构；NetPhos - 3.1在线软件预测CdMYC2的磷酸化位点；运用Plant - mPLoc在线网站预测亚细胞定位；SOPMA在线工具预测CdMYC2的蛋白质二级结构；运用SWISS-MODEL在线工具预测CdMYC2的蛋白质三级结构。

以越南油茶的不同组织部位和果实不同成熟期的cDNA为模板，扩增引物通过 Primer 5.0 软件设计（表1）。使用PerfectStart^® Green qPCR SuperMix试剂盒（AQ601）的两步法进行荧光定量 PCR 反应，按照说明书中的反应体系和程序进行，相对表达量计算采用2^−ΔΔCt 法，利用Graphpad Prism 10.1.2绘图。

根据课题组的越南油茶转录组数据，设计特异性引物，并以越南油茶叶片cDNA为模板，使用PrimeSTAR^®系列高保真PCR 酶扩增CdMYC2基因，获得全长序列长度约为1 850 bp（图1）。测序结果与转录本序列一致。通过ORF finder在线工具对克隆出的CdMYC2的全长序列进行开放阅读框分析，编码序列（CDS）长度为1515 bp，编码504个氨基酸（图2）。

Figure 1.  PCR gel electrophoresis of CdMYC2 gene in C. drupifera

Figure 2.  CDS nucleic acid and amino acid sequence of CdMYC2 gene

通过NCBI-Conserved Domain 对CdMYC2的氨基酸序列进行保守结构域分析。结果发现，CdMYC2基因具有两个保守结构域家族即bHLH-MYC_N super family （25-208 aa）和bHLH_SF super family （298-371 aa）。bHLH_SF super family是一种碱性螺旋–环-螺旋（bHLH）结构域超家族，包括了DNA 结合位点和多肽结合位点（图3）。

Figure 3.  Analysis of conserved domains in CdMYC2

多序列比对和系统发育分析是多物种同源物功能研究的重要方法。将CdMYC2的蛋白序列与从NCBI下载的不同木本植物中的同源蛋白序列进行多序列比对。结果显示，CdMYC2在大多数MYC2中具有高度保守的bHLH结构域（图4）。因此，表明了扩增的CdMYC2属于bHLH家族中的MYC2转录因子。系统发育树结果显示，CdMYC2与同科同属植物茶树（Camellia sinensis）的同源蛋白距离最近；与壳斗科栎属植物白栎（Quercus lobata）、夏栎（Quercus robur）的距离最远（图5）。

Figure 4.  Sequence alignment of CdMYC2 with homologous proteins of different species

Figure 5.  Phylogenetic tree analysis of CdMYC2 protein

利用SignalP - 3.0在线软件预测CdMYC2蛋白信号肽，结果显示CdMYC2蛋白为非分泌蛋白，表明了CdMYC2不会通过细胞的分泌途径被释放到细胞外，而是留在细胞内执行其功能。经过TMHMM v2.0的分析，发现CdMYC2不具有跨膜区域（图6）。通过亚细胞定位网站在线预测，结果显示CdMYC2定位在细胞核，与作为转录因子发挥作用位置一致。NetPhos - 3.1预测CdMYC2的磷酸化位点，发现总共有60个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点有35个，苏氨酸磷酸化位点有20个，酪氨酸磷酸化位点有5个（图7）。

Figure 6.  Prediction of transmembrane structure of CdMYC2 protein

Figure 7.  Prediction results of CdMYC2 protein phosphorylation sites

利用SOPMA 在线工具对CdMYC2蛋白质二级结构分析，结果显示越南油茶 CdMYC2蛋白的二级结构主要由无规则卷曲（Random coil）、α-螺旋（Alpha helix）与延伸链（Extended strand）构成，其中无规则卷曲结构由308个氨基酸残基组成，占比61.11%；α-螺旋结构由146个氨基酸残基组成，占比28.97%；延伸链结构由50个氨基酸残基组成，占比9.92%（图8）。通过SWISS-MODEL在线软件预测CdMYC2蛋白质三级结构，得到与茶树（Camellia sinensis）中的bHLH转录因子 （A0A4V6RY05.1.A）结构相似度（98.41%）较高的蛋白三级结构模型，该结果与进化树分析结果一致，这一高相似度表明两者在结构层面上可能存在紧密的功能关联（图9）。

Figure 8.  Secondary structure prediction of CdMYC2 protein

Figure 9.  The tertiary structure prediction model of CdMYC2 protein

利用ExPASy-ProtParam tool在线分析CdMYC2编码的蛋白质的理化性质。结果显示，CdMYC2分子式（Formula）为C₂₄₂₄H₃₈₅₁N₇₁₃O₇₈₉S₂₁；分子量（Molecular weight）为56279.81；等电点（Theoretical pI）为5.72；在构成该蛋白质的氨基酸中，丝氨酸（Ser）的占比最高，达到了10.1%，不稳定系数（Instability index）为46.62，属于不稳定蛋白，脂溶指数（Aliphatic index）为73.10，亲水性系数（GRAVY）为−0.608，属于亲水性蛋白。使用 ExPASy ProtScale 在线软件对CdMYC2蛋白亲疏水性进行评估，结果显示CdMYC2的亲疏水性值在2.333～−3.411，分布总体上呈现出小于0的趋势，这表明CdMYC2更倾向于亲水性（图10）。

Figure 10.  Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of CdMYC2 protein

为了深入了解CdMYC2的表达模式，使用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术分析其在越南油茶不同组织部位以及果实不同成熟阶段的表达模式。结果表明，在植物的不同组织中，CdMYC2基因在叶片中的表达最为活跃，其次是根和茎中的表达，但在花几乎没有表达（图11-A）。而在果实的不同成熟期中，CdMYC2基因在S2时期表达量最高，其次是S1时期，在S3时期的表达量过低（图11-B）。因此，表明CdMYC2基因的表达模式具有组织特异性和发育阶段特异性。

Figure 11.  Relative expression level of CdMYC2 gene in C. drupifera

越南油茶作为山茶科山茶属植物，其体内含有多种活性成分，其中三萜皂苷是主要活性成分之一。研究表明MYC2能够调控植物中三萜皂苷的合成。然而，越南油茶CdMYC2是否调控三萜皂苷的研究还未见报道。

MYC2属于碱性螺旋–环-螺旋 （bHLH）家族成员，其C末端含有高度保守的bHLH结构域，该结构域是bHLH家族蛋白的一个标志性特征^[11]。在本研究中，对获得的越南油茶CdMYC2进行保守结构域预测，结果显示其含有高度保守的bHLH结构域。进一步通过与其他物种同源蛋白序列的比对分析，我们确认了CdMYC2与多数木本植物中的MYC2一样，均具备这一高度保守的bHLH结构域。该结构域同样存在于银杏^[12]、北柴胡^[13]、蒲公英等药用植物MYC2中。这一结果不仅证实了CdMYC2属于bHLH家族的转录因子，还表明其bHLH结构域在进化过程中具有保守性。然而，多序列比对结果也揭示了越南油茶CdMYC2保守结构域中氨基酸的数目和种类仍与其他物种存在差异，其中，与同科同属茶树的同源蛋白在碱基序列上差异小，相似度占比97.24%，而与其余物种的同源蛋白在碱基序列上相似度均在70%以下，说明在不同物种的进化中MYC2基因并非绝对静态，而是在不同物种间随着亲缘关系的疏远而展现出不同程度的碱基缺失与突变，进化树分析结果进一步印证了这一点，揭示了不同物种MYC2基因间的亲缘关系远近与它们的保守性程度密切相关^[14]。

基因在不同组织或发育阶段的表达水平，往往与其在生物体内的角色密切相关。通过RT-qPCR检测发现，CdMYC2基因表达具有显著的组织特异性和发育阶段特异性。在组织特异性方面，CdMYC2基因在叶片中的表达最为活跃，其次是根部和茎部，而在花中几乎不表达。由此，推测CdMYC2基因在叶片中具有较高的表达量可能是因为需要合成更多的三萜皂苷来抵御环境压力或参与光合作用等生理活动；相对而言，花中对这种化合物的需求较低，因此在花中的表达量最低。对此，已有研究表明，药用植物中三萜皂苷合成与受到环境因子影响有关，同时，bHLH转录因子在植物合成次生代谢物（包括黄酮类、萜类、生物碱类等的生物合成）以应对环境压力过程中发挥了重要作用^[15][11]。此外，有研究还指出光反应产物是初生代谢与次生代谢过程中的重要物质，在三萜皂苷的生物合成途径中，多个关键步骤（如MVA的形成、MVA磷酸化生成MVAP、SS酶催化FPP缩合）均依赖于ATP和NADP（H）的参与^[16]。由于植物叶片是光合作用的主要场所，合理推测CdMYC2基因在越南油茶中表现出的组织特异性表达模式可能与其不同组织对三萜皂苷的具体需求和功能紧密相关。而这一推测与代佳妮^[7]、郑蔚等^[17]的研究发现越南油茶三萜皂苷生物合成途径中的关键酶基因（CdHMGCR、CdSQS、CdSQE）在叶片中的表达量最高，而在花中的表达量则最低的成果相吻合。在油茶果实的发育过程中，CdMYC2基因在9月份表达量最高，其次是8月份，在10月份的表达量过低。据有关报道，在油茶果成熟过程中籽仁三萜皂苷含量呈现出先增加、后下降的趋势，9月的三萜皂苷含量达最高峰，随后在10月份下降^[18]。由此推测CdMYC2基因可能在调控三萜皂苷的生物合成中扮演着重要角色。

综上所述，本研究首次从越南油茶叶片中获得的CdMYC2基因序列，为后续深入解析MYC2转录因子对越南油茶三萜皂苷生物合成积累的调控作用奠定了基础。