Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of Xanthomonas. oryzae pv. oryzicola in rice

准备水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和果胶杆菌（Pectobacterium aroidearum）L6、斯氏泛菌（Pantoea stewartii）SJM1和健康水稻叶片等实验材料，提取DNA用于检测。水稻细菌性条斑病菌特异性序列DNA标准品重组质粒pUC57-AvrRxo1由金斯瑞生物公司根据Genbank序列XOCgx_RS03090合成。

引物和探针由上海生物工程有限公司合成，并稀释至10 μmol·L⁻¹备用；LB液体培养基（胰蛋白胨10 g，酵母粉提取物5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1.0 L，pH 7.4），LB固体培养基（LB液体和琼脂20 g）；pMD18-T载体[宝日医生物技术（北京）有限公司，北京]；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞（上海唯地生物技术有限公司，上海）；PCR扩增产物回收纯化试剂盒（重鼎生物技术有限公司，浙江宁波），快速质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）；基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）；多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）；Taq DNA 聚合酶（天根生化科技有限公司，北京）；TwistAmp^TM 试剂盒（TwistDx公司, 英国）；RAA-nfo核酸扩增试剂（试纸条型）（杭州众测生物科技有限公司）；DL500分子量标记[宝日医生物技术（北京）有限公司，北京]。蓝光切胶仪、PCR仪、Micro Drop超微量分光光度计和QuantStudio^TM 5实时荧光定量PCR仪。

使用细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书所描述的步骤提取水稻细菌性条斑病菌DNA。使用Micro Drop超微量分光光度计对DNA浓度进行检测。最终将 DNA 浓度稀释至94.974 ng·μL⁻¹，用于后续试验。利用EcoRI/SacI技术将基因克隆到pUC57中，重组质粒名为pUC57-AvrRxo1；使用快速质粒小提试剂盒（TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit）提取和纯化pUC57-AvrRxo1质粒。采用RPA方法检测重组质粒pUC57-AvrRxoI是否插入水稻细菌性条斑病菌297 bp的特异性基因序列XOCgx_RS03090。RPA引物序列为：XocRPA-3F（5′-ACGCACTCGAATTTCATAAGAAGCTTAAGGA-3′），XocRPA-3R（5′-GTACATCCGTTCATATATGTCGTGTCGCTCT-3′）。根据TwistAmp^® Basic kit试剂盒说明书进行Basic-RPA方法检测，反应体系：总反应体积50 μL，包括向装有冻干粉的反应管中加入29.5 μL再水化缓冲液（Rehydration buffer）、正反向引物（10 μmol·L⁻¹）各2.4 μL和ddH₂O 12.2 μL，反应体积达到46.5 μL，同时设置阴性对照（NC）；将混合液旋涡振荡简短离心后，用移液枪将1 μL质粒DNA模板加入混合液中；将2.5 μL醋酸镁离子（280 mmol·L⁻¹）加在管盖中，小心关闭管盖，用微型离心机将醋酸镁离子（280 mmol·L⁻¹） 离心到混合液中；立即放入PCR仪器中，在39 ℃下等温扩增反应；反应进行4 min后，取出反应管颠倒混匀并短暂离心，再放回PCR仪器继续反应26 min。RPA扩增后的产物，使用1.5%（0.6 g琼脂糖，40 mL1×TBE缓冲液）琼脂糖凝胶电泳进行结果检测，并使用MEGA11和Snap Gene软件对PCR产物测序后的序列进行序列比对。重组质粒作为标准核酸，用超微量分光光度计测定质粒拷贝数。标准核酸质粒拷贝数计算结果为4.96×10¹⁰ copies·μL⁻¹。

质粒拷贝数（copies·μL⁻¹）=（ρ×6.02×10²³ × 10⁻⁹）/M ，

式中，ρ表示重组质粒的浓度（ng.μL⁻¹），M表示平均分子量。

根据水稻细菌性条斑病菌的特异性基因序列XOCgx_RS03090并基于RPA引物和荧光探针的设计原则，利用Oligo7软件设计筛选获得RPA引物XocRPA-3和Exo-RPA及LFD-RPA探针组合。引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成。

使用水稻细菌性条斑病菌DNA作为扩增反应模版，按照TwistAmp^®Basic Kit试剂盒说明书进行Basic-RPA扩增。对水稻细菌性条斑病菌XocRPA-3引物的Basic-RPA特异性扩增产物进行回收纯化后，与pMD18-T Vector在16 ℃条件下连接低温连接仪，转化到DH5α感受态细胞中，37 ℃过夜培养。挑取白色单克隆菌落转至含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃、180 r·min⁻¹ 恒温振荡培养60 min。肉眼可见浑浊后，送上海生工公司采用Sanger测序方法进行验证。使用MEGA11软件将测序结果与水稻细菌性条斑病菌的特异性基因序列XOCgx_RS03090进行比对。

根据TwistAmp^TM exo试剂盒说明书，进行Exo-RPA扩增反应。在50 μL的反应体积中，分别将29.5 μL再水化缓冲液（Rehydration buffer）、正反向引物（10 μmol·L⁻¹）各2.1 μL、荧光探针（10 μmol·L⁻¹）0.6 μL和 ddH₂O 12.2 μL 加入到含有冻干粉的反应管中，反应体积为46.5 μL，同时设置阴性对照（NC），将混合液旋涡振荡简短离心后，用移液枪转移到0.2 mL PCR反应管中，将1 μL质粒DNA模板加入混合液中，随后将2.5 μL醋酸镁离子（280 m mol·L⁻¹）加在管盖中，小心关闭管盖，用微型离心机将醋酸镁离子（280 m mol·L⁻¹）离心到混合液中，并立即放入QuantStudio^TM 5实时荧光定量PCR仪中，在39 ℃下恒温扩增20 min，每30 s采集1次荧光信号，观察读取荧光信号。为了避免光照影响荧光染料的强度，操作过程探针要注意避光。

按1.6所述配置Exo-RPA反应体系，将水稻细菌性条斑病菌质粒标准品按10倍梯度依次稀释，经预实验后，分别设置4.96、4.96×10¹、4.96×10²、4.96×10³和4.96×10⁴ copies·μL⁻¹ 5个浓度梯度的1 μL质粒DNA模板，进行反应灵敏度检测。每个质粒DNA模板浓度灵敏度检测设置3次重复，同时设置1个阴性对照（NC），总计进行16个RPA反应。使用QuantStudio^TM5 实时荧光定量PCR仪，在39 ℃下恒温扩增20 min，每30 s采集1次荧光值，观察读取荧光信号，确认是否对水稻细菌性条斑病菌进行了有效扩增，进而确定实时荧光定量检测方法对Exo-RPA检测的灵敏度。

按1.6所述配置Exo-RPA反应体系。使用以1 μL 4.96×10²copies·μL⁻¹水稻细菌性条斑病菌质粒为扩增模板的Exo-RPA反应体系，放入QuantStudio^TM 5 实时荧光定量PCR仪器中，分别在35、37、39、41、43 ℃共5个温度梯度，恒温扩增20 min，同时检测荧光信号强度，确定最佳扩增温度。

使用细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书所描述的步骤提取水稻细菌性条斑病菌、水稻白叶枯病菌、果胶杆菌L6和斯氏泛菌SJM1的DNA。使用多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒提取健康的水稻嫩叶基因组DNA，然后在QuantStudio ^TM5荧光定量PCR仪器中进行反应，反应体系同1.6，RPA反应在最佳反应条件39 ℃恒温扩增20 min，每30 s采集1次荧光值，观察读取荧光信号，确认是否对水稻细菌性条斑病菌进行了有效扩增，进而确定 Exo-RPA 检测系统的特异性和实际检测效果。

使用水稻细菌性条斑病菌XOCgx_RS03090基因序列设计的引物，根据RAA-nfo核酸扩增试剂盒说明书进行LFD-RPA方法检测。在50 μL反应体积中，分别将25 μL A Buffer、正反向引物（2 μmol·L⁻¹）各2.0 μL、荧光探针（2 μmol·L⁻¹）0.6 μL和 ddH₂O 12.9 μL加入到含有冻干粉的反应管中，再向反应管中加入5 μL DNA，最后向反应管管盖上加入2.5 μL B Buffer，盖上管盖，上下颠倒轻甩混匀5～6次，低速离心10 s，将反应管放入恒温为39 ℃的PCR仪中，孵育30 min。反应结束后，按照一次性核酸检测试纸条使用说明书进行操作。依据所需检测的样本量，提取对应数量的检测试纸条，并在吸收垫处加注明记号，每根检测试纸条限1次性使用；取8～10 μL核酸扩增产物，点在试纸条的样品垫区域；将试纸条的样品垫部分朝下，插入含有100 μL缓冲液（TE或水或PBS）的1.5 mL灭菌试管中，在3～5 min内观察并记录试纸条上的反应区域，得出检测结果。检测结果：如试纸条检测带和控制带均出现颜色变化，表示检测为阳性反应；若仅控制带显色，则结果为阴性。

将水稻细菌性条斑病菌的重组质粒按照10倍梯度依次稀释，经预实验后，水稻细菌性条斑病分别设置4.96×10⁻¹、4.96、4.96×10¹、4.96×10²和4.96×10³ copies·μL⁻¹ 5个浓度梯度的质粒DNA模板，进行反应灵敏度检测。反应体系按1.10操作，每个质粒DNA模板浓度灵敏度检测设置3次重复，同时设置1个阴性对照（NC）。通过观察检测带的清晰的度和颜色深度，确定LFD-RPA可检测到的最低反应浓度。

为确定最优反应温度，以4.96×10³ copes·μL⁻¹ DNA为模板，反应时间为30 min，温度优化试验的梯度设置：35、37、39、41、43 ℃，共5个温度梯度。另外，每个温度梯度均单独设置3个阴性对照，反应体系按1.10操作，每个温度梯度重复3次实验，反应进行扩增，将试纸条放入稀释液中进行测定观察结果。

为确定最优反应时间，以4.96×10³ copes.μL⁻¹ DNA为模板，反应温度为39 ℃，时间优化试验的梯度设置：0、5、10、15、20 min共5个时间梯度。另外，每个时间梯度均独立设置1个阴性对照，反应体系按1.10操作，每个时间梯度重复3次实验。反应进行扩增，将试纸条放入稀释液中进行测定观察结果。

为验证水稻细菌性条斑病菌LFD-RPA检测方法的特异性，以水稻细菌性条斑病菌、水稻白叶枯病菌、斯氏泛菌、果胶杆菌L6和水稻叶片基因组DNA为模板进行LFD-RPA扩增实验，ddH₂O为阴性对照，反应体系按1.10操作，每个样品重复3次实验，39 ℃反应30 min进行LFD-RPA扩增，验证LFD-RPA方法的特异性。

根据RPA引物和Exo-RPA、LFD-RPA探针组合的设计原则和预试验验证结果，开发出一组水稻细菌性条斑病菌RPA引物和Exo-RPA、LFD-RPA探针组合。引物及探针组合具体序列如表1所示。

以水稻细菌性条斑病菌的XOCgx_RS03090基因重组质粒pUC57-AvrRxo1转入大肠杆菌DH5α宿主的菌液为模板，进行PCR产物扩增。经1.5%琼脂糖凝胶电泳扩增后，条带明亮、清晰、单一，扩增产物分子量大小为150～250 bp；然后使用MEGA11和Snap Gene软件将经Sanger法测序的PCR产物序列与GenBank下载的水稻细菌性条斑病菌297 bp的特异性基因序列XOCgx_RS03090进行比对，结果表明，包含水稻细菌性条斑病菌297 bp的特异性基因序列XOCgx_RS03090已成功插入重组质粒中（图1）。

Figure 1.  1.5% agarose gel electrophoresis of the pUC57-AvrRxo1 amplification product of the recombinant plasmid of Xanthomonas. oryzae pv. oryzicola

以重组质粒DNA（pUC57-AvrRxo1）为扩增模版，使用XocRPA-3引物进行Basic-RPA扩增，构建重组质粒，使用通用引物对M13-F/M13-R进行PCR扩增和Sanger法测序，使用MEGA11软件进行序列比对。结果表明，重组质粒DNA （pUC57-AvrRxo1）包含已插入200 bp目的片段，标准品质粒能用于RPA扩增反应体系的检测及优化。

由荧光信号曲线（图2）可知，从采集荧光信号（即0 min）开始计时可在12 min之内检测到4.96～4.96×10⁴copies·μL⁻¹ 5个浓度的样品，最低检测限为4.96 copies·μL⁻¹。

Figure 2.  Exo-RPA amplification curves based on different DNA concentrations of Xanthomonas. oryzae pv. oryzicola plasmid standards

由荧光信号曲线（图3）可知，扩增5 min后，35、37、39、41、43 ℃均检测到荧光信号。随着反应时间的增加荧光强度逐渐增强。综合考虑起峰时间和荧光信号强度，最终确定反应的最佳扩增温度为39 ℃。

Figure 3.  Exo-RPA application curves plot of Xanthomonas. oryzae pv. oryzicola plasmid standards under different temperature conditions

由荧光信号曲线（图4）可知，随着反应时间的增加，水稻细菌性条斑病菌样品在4 min后荧光强度逐渐增强，检测结果均为阳性，其他非目标样品在4 min后荧光强度无明显有扩增现象，均为阴性，表明建立的Exo-RPA方法可以很好的检测水稻细菌性条斑病菌。

Figure 4.  Specific amplification curve of Exo-RPA of Xanthomonas. oryzae pv. oryzicola

将水稻细菌性条斑病重组质粒pUC57-AvrRxo1模板浓度对LFD-RPA检测方法的灵敏性进行评估，浓度稀释到4.96 copies·μL⁻¹ 均能看到清晰的检测带，LFD-RPA的最低检测限为4.96 copies·μL⁻¹（图5）。

Figure 5.  LFD-RPA sensitivity determination of standard recombinant plasmid pUC57-AvrRxo1

由图6可知，反应在35～43 ℃条件下均出现检测带，39 ℃检测带颜色最明显。这表明LFD-RPA能够在常温条件下进行检测，确定最佳反应温度为39 ℃。

Figure 6.  Optimization of reaction temperature for LFD-RPA assay of Xanthomonas. oryzae pv. oryzicola

由图7可知，在反应5 min时即可在检测靶标样品的侧流层析试纸条上观察到阳性检测带，说明在5 min时所产生的扩增产物即可被试纸条法检出。此外，在5～20 min反应时间内均可观察到检测带，考虑到反应时间、扩增产物的稳定性及肉眼观察的清晰可辨别程度，确定最佳反应时间为20 min。

Figure 7.  Optimization of reaction time for LFD-RPA assay of Xanthomonas. oryzae pv.oryzicola

在39 ℃ 恒温以及20 min扩增时间的最佳反应条件下，进行LFD-RPA方法针对水稻细菌性条斑病菌的检测特异性验证，只有检测水稻细菌性条斑病菌的LFD-RPA显示红色检测带，其他均未出现条带，结果为阴性（图8）。这说明本体系未与所选的其他病原菌出现交叉反应，表明本套nfo-RPA特异性引物及探针组合能够准确区分水稻细菌性条斑病菌及其他病原菌菌株，具有良好的特异性。

Figure 8.  RPA-LFD specificity validation and detection of actual samples of Xanthomonas. oryzae pv. oryzicola

水稻含有丰富的碳水化合物、蛋白质、维生素和矿物质等营养成分，是中国主粮作物。水稻细菌性条斑病是具有爆发性和破坏性的传染性病害。本研究通过水稻细菌性条斑病菌特异性基因序列XOCgx_RS03090设计RPA引物及Exo-RPA和LFD-RPA探针，建立了Exo-RPA荧光检测体系和LFD-RPA检测体系。将本实验设计的水稻细菌性条斑病菌RPA正反向引物XocRPA-3F与XocRPA-3R经过NCBI Basic Local Alignment Search Tool （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对后，仅比对中的水稻细菌性条斑病菌基因组同源相似度达到100% （E-value=1×10⁻⁵）。这提示本研究团队设计的Exo-RPA引物具有仅针对水稻细菌性条斑病菌的特异性。

目前，前人检测水稻细菌性条斑病菌中，应用实时荧光PCR技术检测该病害的最低质粒DNA浓度为30. 6 fg·μL⁻¹及菌悬浮液为1.0×10³ cfu·mL⁻¹ ，该方法虽然有高特异性，但检测成本相对较高^[4]。应用Taqman荧光定量PCR检测水稻细菌性条斑病菌最低灵敏度为2.0×10¹ cps·μL⁻¹，检测时长约为2 h，但该方法容易出现非特异性扩增，比较费时费力，成本高^[6]。应用padlock探针和Macroarray技术相结合检测水稻细菌性条斑病菌，操作过程繁琐且检测时间长，检测成本高^[8]。应用多重PCR检测水稻细菌性条斑病菌最低灵敏度为10³ cfu·mL⁻¹ ，但由于在同一反应中扩增多个目标序列，增加了交叉污染的可能性，引物设计难度大，非特异性产物可能增加，因为不同目标序列之间的扩增效率可能存在差异，多重PCR技术在定量分析方面可能存在一定难度^[9]。应用PMA-PCR诊断技术检测水稻细菌性条斑病菌最低灵敏度为2×10⁴ cfu·mL⁻¹，但PMA-PCR涉及多个步骤，包括PMA处理、洗涤、PCR扩增和数据分析等^[11]。这些步骤需要仔细的操作和适当的实验条件，因此相对于传统的PCR方法来说更为复杂。虽然PMA能够与死细胞中的DNA结合并阻止其PCR扩增，但某些情况下，死细胞可能无法被完全去除或区分。这可能导致假阳性结果的出现，特别是在样本中存在大量死细胞时。应用LAMP诊断技术检测水稻细菌性条斑病菌最低灵敏度为2.0×10² cps·μL⁻¹，检测时长为40～60 min，具有高灵敏度，稳定性好，但检测时间长，引物设计复杂，需要针对靶基因的特定区域设计4条特异引物，增加了引物设计的难度，扩增过程涉及到多个循环，容易发生非特异性扩增和污染问题，导致假阳性结果^[6]。应用RPA/Cas12a检测水稻细菌性条斑病，通过荧光定量PCR仪检测水稻细菌性条斑病菌检测限为10 fg·μL⁻¹，通过可视化检测，DNA检测限为1 fg·μL^−1[25]。

RPA 检测技术反应迅速、操作简单，无需复杂仪器，能在便携式微型荧光定量 PCR 仪上恒温扩增现场检测，20 min内即可检测到极低浓度病原体特异性DNA，具有更高的灵敏度和准确性及更短的反应时间。本研究建立的水稻细菌性条斑病菌 Exo-RPA 检测体系与之前的快速核酸检测方法相比，具有可在接近人体温度或室温的39 ℃进行扩增反应，检测灵敏度更高、操作步骤更简便的优点，具备针对水稻细菌性条斑病菌的快速检测能力。