Antioxidant activity of ethanol extract of kidney tea and its activity against Caenorhabditis elegans

肾茶由海南大学林学院于旭东副教授提供，采自海南省儋州市宝岛新村海南大学农科基地。野生型秀丽隐杆线虫N2和尿嘧啶缺陷型大肠杆菌OP50，均由美国新泽西州立罗格斯大学（Rutgers University）狄榕老师惠赠。NGM和LB培养基参考文献^[13]制作，实验中其他试剂（如 DPPH、ABTS、硫酸镁、氯化钙等）均购自索莱宝公司，均为市售分析纯。

肾茶乙醇提取物（KTe）提取方法参考张荣荣等^[14]方法并做修改：将干燥的肾茶茎和叶3 kg粉碎后加入12 L 95%（v/v）乙醇浸泡提取3 d（液料比为w_肾茶∶v_乙醇=4∶1），共提取3次，多层纱布过滤，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到KTe，于4 ℃ 冰箱保存，备用。

KTe对DPPH、ABTS自由基清除活性测定参考Huang等^[15]方法做部分修改：1）分别取2 mL浓度为0.05、0.1、0.5 、1.25 、2.5 、5 、10 μg·mL⁻¹的KTe溶液，使用维生素C（Vc）作为阳性对照。2）KTe溶液和阳性对照分别与2 mL DPPH、ABTS工作液混匀，避光反应30 min，在紫外分光光度计517 nm（DPPH）、734 nm（ABTS）处测定反应液吸光度，3次重复。3）计算清除率^[15]。

秀丽隐杆线虫的培养及同步化参考Epstein等^[15]方法：以大肠杆菌OP50为食物，采用NGM固体培养基20 ℃培养。在本研究中如无特别说明，将灭活的OP50（65 ℃ , 30 min）涂在NGM平板中进行实验，给药时间为7 d。

含药NGM平板制作参考文献^[16]方法修改。1）KTe母液的制备：取10 mg的肾茶乙醇提取物加入1 mL的无水乙醇中，配置成10 g·L⁻¹母液，溶解于无水乙醇中，冷藏备用。2）给药方式：同步化后的秀丽隐杆线虫从L4期开始，每天将虫转移到新的培养基上，从而确保秀丽隐杆线虫保持同步，保证食物充足，给药3、7 d后，测定生理指标。3）溶剂对照（SC）：使用最大浓度的处理中无水乙醇含量，1%无水乙醇做溶剂对照。

寿命实验方法参考文献^[17]并做部分修改。同步化后将L4期的秀丽隐杆线虫分别接入20 、50 、100 μg·mL⁻¹浓度下KTe中孵育7 d，每天更换新鲜培养基，以OP50为对照。于第7 d将各组线虫转移至普通NGM培养基上，之后每2 d更换新鲜培养基。每处理10条线虫。每处理重复3次。从转移当天起开始统计线虫存活时间，转移当天记为第0 d。每天观察线虫的生长情况，记录线虫死亡数量，挑出死亡的线虫。直至所有线虫死亡，计算线虫的平均寿命，绘制寿命曲线。

同步化后将L4期的秀丽隐杆线虫分别接入20 、50 、100 μg·mL⁻¹ 浓度下KTe中孵育7 d，每天更换新鲜培养基，以OP50为对照，每处理10条线虫，每处理重复3次。每日观察记录产卵数及孵化的小虫数量，直至不再观察到线虫产卵为止，计算总产卵数及总孵化数，计算孵化率。

同步化后将L4期的秀丽隐杆线虫分别接入20 、50 、100 μg·mL⁻¹浓度下KTe中孵育，以OP50为对照，每天将秀丽隐杆线虫转移到新的NGM平板中。在处理3 d、7 d后进行脂褐素荧光检测。将培养基中的线虫用M9缓冲液转移至1.5 mL离心管中，自然沉降1 min后，弃上清，吸取左旋咪唑溶液（5 mmol·L⁻¹）40 μL于离心管中，麻醉线虫3 min。制作2%琼脂凝胶片，在凝胶片上滴一滴M9缓冲液（20 μL），将挑取线虫移至M9缓冲液滴中，盖片。倒置荧光显微镜观察拍摄线虫肠道脂褐素自发荧光。拍摄条件：激发波长360～370 nm，发射波长420～460 nm，统计分析图片中脂褐素自发荧光强度，每处理10条线虫，每处理重复3次。

同步化后将L4期的秀丽隐杆线虫分别接入20 、50 、100 μg·mL⁻¹ 浓度下KTe中孵育，以OP50为对照，每天将线虫转移到新的NGM平板中。在处理3 、7 d后计数30 s的咽抽次数。每处理10条线虫，每处理重复3次。

选择20 s内头部摆动和身体弯曲次数进行评价，同步化后将L4期的秀丽隐杆线虫分别接入20 、50 、100 μg·mL⁻¹浓度下KTe中孵育，以OP50为对照，每天将线虫转移到新的NGM平板中。于3 、7 d时随机挑取状态良好的秀丽隐杆线虫进行测定。头部摆动次数定义为秀丽隐杆线虫头部从一侧摆动到另一侧，再摆动回最开始的一侧，记为1次；身体弯曲次数定义为秀丽隐杆线虫相对于身体纵轴方向上的1个波长的移动，记为1次。每处理10条线虫，每处理重复3次。

同步化后将L4期的秀丽隐杆线虫分别接入20 、50 、100 μg·mL⁻¹ 浓度下KTe中孵育，以OP50为对照，每天将线虫转移到新的NGM平板中。在处理3、7 d后测定线虫体长和体宽。用M9缓冲液将秀丽隐杆线虫洗涤并转移到1.5 mL离心管中，静置3 min，弃上清，重复3次。再用M9缓冲液定容至1 mL，将装有秀丽隐杆线虫的1.5 mL离心管转移到55 ℃ 恒温水浴锅中，3 min后秀丽隐杆线虫身体僵直取出离心管于室温静置，然后转移至干净的载玻片上，采用体式显微镜和显微成像系统进行拍照并分析秀丽隐杆线虫的体长和体宽。每处理10条线虫，每处理重复3次。

寿命实验所测数据使用用Prism 5软件（美国 GraphPa Software公司）中的Kaplan-Meier生存测定法绘制生存曲线。数据使用Statistical Product Service Solutions（SPSS，IBM公司）软件进行统计学分析。采用Duncan进行单因素方差分析（P≤0.05）采用Tukey’s 方法进行多重比较分析差异显著性（P≤0.05），所有数据均基于平均值±标准差（平均值±SEM）

使用Prism 5生成图形。使用ImageJ 1.51软件分析荧光强度和对孵化量、产卵量、体长、体宽、每20s头部摆动、身体弯曲的次数、荧光强度等数据进行归一化处理。

测定加入不同浓度的抗氧化剂或待测样品后的吸光值变化可以筛选自由基清除剂，肾茶提取物可以与DPPH和ABTS自由基反应引起溶液颜色改变，从而导致吸光度的变化。使用DPPH和ABTS自由基清除方法评价肾茶提取物的体外抗氧化活性。由图1可知，KTe对DPPH、ABTS自由基均具有清除作用，且呈一定的量效关系。拟合的自由基清除方程分别为y=1.38x+42.15、y=3.58x+38.87，R²值均大于0.9，根据方程计算KTe在5.69 μg·mL⁻¹对DPPH自由基清除率为50%，在3.11 μg·mL⁻¹ 时ABTS自由基清除率为50%。而Vc对DPPH、ABTS产生50 %自由基消除率的浓度分别为453.28 、85.29 μg·mL⁻¹。以上结果表明KTe具有良好的体外抗氧化活性。

Figure 1.  The ability of KTe to eliminate DPPH free radical and ABTS free radical

在正常培养条件下，秀丽隐杆线虫寿命约为14～21 d。从KTe对秀丽隐杆线虫寿命的影响结果（图2）可见，各浓度下KTe处理组秀丽隐杆线虫寿命与对照组差异不显著。对照组线虫平均寿命为19.07 d，最大寿命为24 d，SC和20、50、100 μg·mL⁻¹ KTe处理组的线虫平均寿命依次为19.00 、18.20、17.33、16.73 d；最大寿命依次为20、24、22、21 d。以上结果表明KTe对秀丽隐杆线虫无延寿作用，且随着用药浓度增加，秀丽隐杆线虫最大寿命还有所缩短。

Figure 2.  Effects of KTe on lifespan of C.elegans

秀丽隐杆线虫的雌雄同体个体的产卵数量和孵化率，不仅可以反映化合物对其生殖毒性的影响，还可能表明该化合物是否具有通过抑制生殖活动来延长秀丽隐杆线虫寿命。测定不同浓度肾茶乙醇提取物对秀丽隐杆线虫产卵量、孵化量以及孵化率的影响结果（图3 B、C）发现，与对照相比，20、50 μg·mL⁻¹肾茶乙醇提取物处理后的线虫产卵量和孵化量无明显差异；100 μg·mL⁻¹肾茶乙醇提取物处理后的线虫产卵量和孵化量有显著性差异提高，所有浓度的肾茶乙醇提取物处理对线虫孵化率均无显著性影响（图3-A ）。以上结果可见，KTe不会减弱线虫生殖能力。

Figure 3.  Effects of KTe on hatching rate（ A ）、 hatching volume（ B ）and egg volume（ C ）of C.elegans

线虫脂褐素含量可反应线虫衰老程度，在荧光条件下，线虫发出的光越亮代表体内积累的脂褐素越多。KTe对秀丽隐杆线虫脂褐素的影响结果（图4-A、C）表明，与对照相比，50、100 μg·mL⁻¹KTe处理3 d后，脂褐素的荧光强度弱且荧光强度显著低于对照组；KTe处理7 d后荧光强度显著低于对照组。以上结果表明，KTe可有效降低线虫在生长期间积累脂褐素的量。

Figure 4.  Effects of KTe on health parameters of C. elegans

咽抽速率能够反应秀丽隐杆线虫摄取食物能力，摄食能力强弱是秀丽隐杆线虫健康水平评价指标。KTe对秀丽隐杆线虫咽抽速率的影响结果（图2-B）发现，KTe处理3 d后，20、50、100 μg·mL⁻¹KTe处理的线虫咽抽次数未出现显著变化；KTe处理7 d后，与对照组相比，KTe处理各浓度每20 s咽抽次数显著性下降，因此秀丽隐杆线虫的咽抽速率显著性下降。以上结果表明，随着用药浓度增加，KTe不会影响低龄线虫的咽抽速率，但随着用药时间增加，KTe会减少老龄线虫咽抽速率。

秀丽隐杆线虫的头部摆动和身体弯曲是移动和寻找食物的重要方式。秀丽隐杆线虫的活动随着年龄的增长而减少，在生命的后期，秀丽隐杆线虫对外界刺激变得不敏感，秀丽隐杆线虫头部摆动和身体弯曲的测定结果可以直观反映秀丽隐杆线虫的运动能力和活力。不同浓度肾茶乙醇提取物对秀丽隐杆线虫头部摆动影响的测定结果（图5）表明，使用20 、50、100 μg·mL⁻¹浓度KTe处理线虫3 d后，头部摆动频率均呈上升的趋势，与对照组相比均存在统计学差异（图5-A）；使用20 、50 、100 μg·mL⁻¹肾茶乙醇提取物处理线虫7 d后，与对照组相比，各浓度处理组的秀丽隐杆线虫头部摆动和身体弯曲显著减少（图5 -B）。以上结果表明，随着用药浓度增加，KTe能提高低龄线虫的运动活力，随着用药时间增加，KTe会减少老龄线虫运动活力。

Figure 5.  Effects of KTe on body bending and head swing of C.elegans

线虫体长体宽可以反应秀丽隐杆线虫的生长发育状态，生长期线虫体长增加，进入衰老期，线虫体长会明显的缩短。KTe对秀丽隐杆线虫体长体宽影响的测定结果（图6A、B）发现，处理3 d，所有浓度的KTe处理组的体长和体宽均呈现上升的趋势，并且与对照组有显著性差异；而处理7 d，所有浓度的KTe处理组的体长与体宽均呈现下降的趋势，并且与对照组相比差异显著。以上结果表明，随着用药浓度增加，KTe会增加低龄线虫的体长和体宽，随着用药时间增加，KTe可减少老龄线虫的体长和体宽。

Figure 6.  Effects of KTe on body length and body width of C.elegans

肾茶在医学中起到消炎止痛、抗衰老的效果，

而消炎止痛的作用主要是通过消除自由基来实现的，自由基（Free radical）是指能独立存在，含有未成对电子的原子、原子团、分子或离子。一般认为，机体的新陈代谢过程中会有大量自由基产生，这些自由基引起细胞损伤进而导致衰老，从另一方面来说，衰老是自由基损伤累积的结果，已有研究表明，适当清除自由基可以减少疾病的发生并有效的延长生物的寿命^{[18 − 19]}。本研究测定肾茶乙醇提物（KTe）抗氧化能力发现，KTe对DPPH、ABTS自由基均具有较强的清除作用，且呈一定的量效关系，与前人的研究结果相似^{[20 − 21]}。KTe具有体外抗氧化活性可能是由于肾茶中富含黄酮类化合物，具有较强的抗氧化作用。

近年来，有研究发现一些植物提取物可对秀丽隐杆线虫生长和衰老产生影响，例如，草莓提取物可以延长秀丽隐杆线虫寿命^[22]。人参提取物具有广泛的生物活性和对年龄相关疾病有健康益处，也可以延长秀丽隐杆线虫寿命^[23]。银杏种仁粉提取物含有丰富的生物碱和黄酮类化合物，可以通过介导脂质代谢和自噬延长秀丽隐杆线虫的寿命^[24]。本研究发现KTe有体外抗氧化能力，因此以秀丽隐杆线虫为供试对象，对肾茶乙醇提取物的作用进行了评估，结果显示，给药3 d后，KTe对秀丽隐杆线虫的各项指标如头部摆动、身体弯曲、体长体宽均表现为促进作用，而在给药7 d后，与对照相比，秀丽隐杆线虫脂褐素积累量显著减少，线虫寿命却未增加，所测量的各项指标也均受到抑制，同时，线虫产卵量、孵化量显著减少。分析给药3 d与7 d作用明显不同的原因可能是给药时间太长，导致过量的KTe反而会对线虫产生不良的影响，使得各指标受到抑制，这也可能是在处理7 d后的秀丽隐杆线虫寿命减少的原因。KTe富含的黄酮类、酚酸类化合物起到的抗氧化活性可能是促进秀丽隐杆线虫前期（3 d）运动能力的原因，但秀丽隐杆线虫在长时间暴露于这些化合物环境中（7 d）也会影响产卵量和孵化量，温伟省等^[25]提出长期大剂量使用维生素B1、维生素B6、维生素A等均可导致很多的副作用，包括头痛、疲倦、烦躁、食欲减退、腹泻等不良影响。Dam指出虽然适量饮用咖啡与降低2型糖尿病风险相关，但过量摄入咖啡因会对健康产生不良影响^[26]，因此秀丽隐杆线虫在长时间接触KTe时也会出现不良影响，同时KTe中其他活性成分可能也具有协同作用。

KTe具有良好的体外抗氧化活性，具有清除DPPH和ABTS自由基能力。在用药浓度较低且用药时间较短时，KTe对秀丽隐杆线虫咽抽速率无影响，头部摆动、身体弯曲、体长、体宽会得到促进；但当用药浓度较高且用药时间延长，咽抽速率、头部摆动、身体弯曲、体长、体宽都会受到抑制，最终缩短其寿命。此外，在产卵期对秀丽隐杆线虫用药，则会增加其产卵量，而不会影响卵的孵化。本研究结果可为后续肾茶的开发利用提供一定的实验依据。