Isolation, identification and antibacterial activity of biocontrol Streptomyces Q2-02

样品Q1、Q2分别采自海南省琼海市东平农场荒芜地带和山区；H3采自海南省海口市火山口地质公园；S4采自海南省海口市琼山区橡胶林荒芜地带；W5采自海南省文昌市红树林；D6采自海南省热带植物园。

供试培养基为高氏一号固体培养基、高氏一号培养液和PDA培养基^[11]。

橡胶炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides Penz. Sace（ATCC12097），橡胶落叶棒孢霉病菌Corynespora cassiicola（Berk. & Curt.）Wei（ATCC42584），芒果蒂腐病菌Botryodiplodia theobromae Pat.（CBS 164.96），香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae Berk. & Curt.（ACCC31244），水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani Kühn（ATCC16125），椰子灰斑病菌Pestalotia palmarum Cooke（K（M）92651），西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp. niveum（ACCC36116），橡胶黑团孢病菌Periconia heveae（Stevenson & Imle.）（BPI 71424），芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.（ATCC12097），以上菌种均由海南大学热带农林学院植物保护系骆焱平课题组提供。

可溶性淀粉购自上海麦克林生化科技有限公司；K₂HPO₄购自上海源叶生物科技有限公司；葡萄糖、MgSO₄、NaCl、KNO₃均购自西陇科学股份有限公司；琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司；45 %噻菌灵悬浮剂购自拜耳（中国）有限公司；10%井冈霉素水剂购自江苏瑞德邦化工科技有限公司；‘台农l号’芒果果实采自三亚南田农场；水稻（Oryza sativa）种子为‘博Ⅱ优15号’；灭菌土采自海南大学热带农林学院教学基地，过20目筛，160 ℃灭菌2 h。

按照陈乙煌等^[12]的方法从采集的土壤中分离放线菌。然后采用逐级划线法纯化放线菌。

按照李桂花等^[13]的方法将分离获得的放线菌株与供试靶标菌株进行对峙培养，将靶标菌接在PDA培养基中央作为对照。观察放线菌对病原菌的抑制效果，测量菌落直径，按照下列公式计算抑菌率。将具有抑制作用的菌株按照对峙培养的方法进行再次筛选。

抑菌率=（对照组菌落直径−处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100%。

Q2-02的鉴定 用插片法^[14]对菌株Q2-02进行形态学鉴定，在显微镜下观察其形态特征并拍照。将放线菌Q2-02接种到高氏一号培养基平板上，待菌落长到适合大小切取2 mm×3 mm大小的样品，进行扫描电镜样品处理，干燥喷金后用电镜观察放线菌气生菌丝和孢子^[15]。

提取菌株Q2-02的总DNA，使用16S rDNA通用引物（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′, 1492R: 5′-CCTTACCTTGTTACGACTT-3′）^[16]，进行16S rDNA的PCR扩增，PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；4 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。使用琼脂糖凝胶电泳进一步纯化PCR产物后，由上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序。使用NCBI进行同源性比对，通过MEGA 11软件进行系统进化树的构建。

参照《链霉菌鉴定手册》^[17]对菌株Q2-02进行生理生化特性测定，包括明胶液化、牛奶凝固与胨化、淀粉水解、纤维素水解、硫化氢产生、碳源利用等生理生化特征。

经过实验发现，Q2-02具有广谱抑菌活性，其中，对芒果蒂腐病菌的抑菌率最高。因此，选择Q2-02进行下一步活性测定。将链霉菌Q2-02接种到高氏一号培养基上，28 ℃培养5 d。用移液枪移取1 mL 10⁷ CFU·mL⁻¹的Q2-02孢子悬浮液加入至高氏一号培养液中，28 ℃、180 r·min⁻¹振荡培养4 d获得菌株发酵液，1000 r·min⁻¹离心10 min，将上清液依次稀释至10倍、50倍、100倍，备用。

选择无病虫害、无机械损伤、成熟一致的芒果果实，平肩剪蒂，用大量自来水冲洗干净，阴干。将处理好的芒果放入上述不同稀释倍数的Q2-02发酵液中浸泡5 min，自然晾干。每个处理4次重复，每次重复10个果。28 ℃、相对湿度80%～90%的条件下贮藏。以45 %噻菌灵悬浮剂800倍液处理作为药剂对照，以无菌水处理作为空白对照。根据果实成熟情况，每隔3 d观察1次，记录果实的发病等级，计算其发病率、病害指数及防效。

芒果蒂腐病的分级标准如下：0级，无病；1级，病斑面积占果实面积的5%以下；3级，病斑面积占果实面积的6%～15%；5级，病斑面积占果实面积的16%～25%；7级，病斑面积占果实面积的26%～50%；9级，病斑面积占果实面积的50%以上^[18]。

发病率=（病果数/处理总果数）×100%，

病害指数=Σ（病果级别×该级别果数）/（最高病果级别×处理总果数）×100%，

防治效果=（空白对照区病害指数－实验处理后病情指数）/空白对照区病害指数]×100%。

选取优良水稻种子，用5%次氯酸钠消毒5 min，30 ℃催芽至露白。选取露白、健壮的种子播种于育苗钵中，待出苗后20 d移栽至口径为30 cm装有灭菌土的花盆中，每盆2丛，每丛10株。待水稻分蘖盛期，用供试菌株Q2-02发酵液以喷雾的方式处理水稻植株，每盆每丛喷施20 mL。待发酵液稍干后将制备好的带有水稻纹枯病菌的秸秆夹在水稻丛中，每丛4根秸秆。设无菌水为空白对照，10%井冈霉素水剂100倍液作为药剂对照，每处理10盆。20 d后统计病害指数及防效。

水稻纹枯病害分级标准如下：0级：全株无病；1级：第四叶及其以下各叶鞘、叶片发病（以顶叶为第一片叶）；3级：第三叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；5级：第二叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；7级：剑叶叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；9级：全株发病，提早枯死^[19]。

发病率=（病株数/处理总株数）×100%，

病害指数=Σ（病株级别×该级别株数）/（最高病株级别×处理总株数）×100%，

防治效果=（空白对照区病害指数−实验处理后病情指数）/空白对照区病害指数]×100%。

调查数据经使用SAS软件Duncan新复极差法进行多重比较，使用Excel表格进行制表。

采用梯度稀释分离法对分别来自海南不同地区6个土样进行分离、纯化，共得到放线菌285株。从表1可知，从海南省不同的地区采集的6个土壤样品中，5号土样分离得到菌株最多，有88株，占所分离株的30.8%；其次是2号土样，有77株，占所分离株的26.9%；1号土样分离出55株放线菌，占所分离株的29.2%；3号土样分离出44株放线菌，占所分离株的15.4%；4号土样和6号土样中分离11株出放线菌，均占所分离株的3.8%

以9种植物病原菌作为靶标菌，对分离纯化得到的285株放线菌进行皿内拮抗初筛，有拮抗活性的菌株编号及菌落特征见表2。测定发现，有抑制效果的放线菌共12株，占分离菌株的4.2%，其中，5株拮抗菌株产生了可溶性色素。在海南不同地区采集的6种土样中，琼海土样Q2分离出有效菌株的抑菌效果最为理想，有5株，占有效菌株比例41.7%。文昌土样W5次之，有3株，占有效菌株比例25.0%。琼海土样Q1和火山口土样H3有效菌株都为2株，都占有效菌株比例16.7%。

从表3可知，供试的12株放线菌中，菌株Q2-02抑菌效果最好，对9种靶标菌均有较好的拮抗效果，尤其对芒果蒂腐病菌及芒果炭疽病菌的抑制率均大于90%，对其余的靶标菌抑菌率均大于60%，可见该菌株抑菌谱较广。其次，菌株Q2-03、Q2-01、Q2-06、Q09也有较好的抑菌效果，但均不如Q2-02抑菌谱广。

在高氏一号培养基上培养的Q2-02菌株，其菌落颜色为灰白色，培养基有淡棕色素沉淀，菌落大小适中，近圆形，气生菌丝生长不茂盛（图1-a）。经插片培养，观察到菌丝形态如图1-b所示，Q2-02菌落成灰白色绒粉状，菌株的菌丝茂盛，气生菌丝多分支，直线形。

Figure 1.  Morphological characteristics of strain Q2-02

链霉菌的孢子丝形态和孢子形态是链霉菌的非常重要的鉴定特征，由图1-c、图1-d可以看出，菌株Q2-02的孢子丝较长呈螺旋状，孢子表面长有排列稀疏的尖刺状凸起。

对菌株进行16S rDNA序列测定，共获得1 447个碱基，将其在NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上进行注册，获得注册号为KP890853，将Q2-02的序列在NCBI中进行同源性比对，通过MEGA 11软件构建系统进化树的，结果表明（图2），供试菌株Q2-02与两株卢娜林瑞链霉菌（Streptomyces lunalinharesii）亲缘关系最近，支持率为87%。

Figure 2.  Phylogenetic tree of strain Q2-02

由表4可知，菌株Q2-02在不同的培养基上其培养特征不同。其中，在高氏一号培养基、马铃薯浸汁琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基和马铃薯块培养基上，菌丝生长比较茂盛；气生菌丝的颜色在高氏一号、察氏一号、马铃薯浸汁琼脂培养基上均为灰白色，葡萄糖天门冬素琼脂、马铃薯块上均为粉白色；基内菌丝均为白色，有灰白、乳白、粉白3种；菌株Q2-02在高氏一号培养基、马铃薯块培养基和葡萄糖酵母膏琼脂上产生可溶性色素，其颜色分别为淡棕、白色和淡可可棕。

由表5可知，Q2-02能液化明胶，不能使牛奶凝固，也不能使其胨化，能水解淀粉，不能在纤维素上生长，不产生硫化氢沉淀；对不同的碳源利用情况不同，不能利用葡萄糖、蔗糖和甘露醇，可以利用果糖、肌醇、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖。结合菌落形态、生理生化特征发现，Q2-02与文献[20]报道的娜林瑞链霉菌RCQ1071的生理生化特征也基本一致，因此，将菌株Q2-02初步鉴定为卢娜林瑞链霉菌（Streptomyces lunalinharesii）。

采用浸果法测定Q2-02发酵液不同稀释倍数下对芒果贮藏期间芒果蒂腐病的防效。结果发现（表6），Q2-02发酵液上清液对芒果蒂腐病的防效均有浓度依赖效应，即随着浓度的升高防效显著提升。供试的3个浓度中，发酵上清液稀释10倍防效最为理想，对芒果蒂腐病的防效均达83.2%以上，显著高于药剂对照45%硫苯唑悬浮剂800倍液；其次50倍稀释液对两种病害也有较好的防效，与药剂对照效果相当；相比之下100倍稀释液对2种病害基本没有防治效果，可能是发酵液中抑菌物质较少所致。

在对水稻纹枯病的盆栽防效测定中，Q2-02发酵液呈现很好的防治效果，防效可达76.9%，显著高于10%井冈霉素水剂1 000倍液（表7）。

链霉菌在植物病害绿色防控领域发挥着重要的作用，如王兰英等^[21]从海南香蕉根系土壤中分离出对香蕉枯萎病具有良好防治作用的金黄垂直链霉菌HN6；王蕊等^[22]从甘肃省嘉峪关七一冰川土样中分离的链霉菌QY-26能够很好的控制胶孢炭疽菌引起的橡胶树炭疽病。海南省地理位置独特，生态环境多样，广受微生物领域科研者们关注。本研究对海南不同地区的土壤样品进行分离和活性筛选，获得一株拮抗链霉菌Q2-02，进行分子生物学鉴定发现，该菌株与卢娜林瑞链霉菌（S. lunalinharesii）亲缘关系最近，其生理生化特性与SOUZA等^[20]报道的卢娜林瑞链霉菌（S. lunalinharesii）一致。有研究表明，卢娜林瑞链霉菌可以有效防治香蕉枯萎病^[23]，但关于该菌株在芒果保鲜和水稻病害防控领域研究还未见报道。芒果和水稻作为热带重要的农作物在海南省广泛种植，王晨光^[24]的研究表明由于长期的化学防治，芒果蒂腐病原菌对田间常用的防治药剂苯醚甲环唑和咪鲜胺的敏感性出现下降且敏感性下降在传代实验中表现出稳定遗传，不同地区的水稻纹枯病菌也对部分化学防治药剂的敏感性产生了下降^[25,26]，生防菌剂对延缓抗药性，保障农业生产具有重要意义，本研究发现，菌株Q2-02发酵液稀释10倍后对芒果蒂腐病的防效可达83.2%，对水稻纹枯病的盆栽防效也可达76.9 %，均显著高于相应的阳性对照噻菌灵和井岗霉素，可见菌株Q2-02具有很好的生防菌剂开发潜力，具有进一步开发为防治芒果蒂腐病以及水稻纹枯病生防制剂的价值。

众所周知，链霉菌次生代谢产物一直以来都是科研者开发生物农药的资源。如春雷霉素可以用来防治多种植物病害^[27]。本研究发现，菌株Q2-02具有广谱的抑菌特性，并且其发酵液滤液可以有效防治芒果蒂腐病和水稻纹枯病，因此后续开展次生代谢产物的研究对微生物农药的研制也具有重要的意义。

本研究在采集到的海南省6个地区的土样中分离出285株放线菌，通过平板对峙法筛选出具有良好农用活性的链霉菌Q2-02，经过分子生物学、生理生化和形态学实验，初步将菌株Q2-02鉴定为卢娜林瑞链霉菌（Streptomyces lunalinharesii），防效实验表明其发酵上清液对芒果蒂腐病及水稻纹枯病的防效均显著高于阳性对照45 %噻菌灵悬浮剂和10%井冈霉素水剂。本研究丰富了我国生防菌资源库，为新的活体生防菌剂的开发打下基础。