Genetic diversity and genetic differentiation of Bursaphelenchus xylophilus in Guangxi based on mt COI sequences

本研究所用的67个松材线虫的虫株样本分别于2023年取自广西壮族自治区8个区县的松材线虫病疫区（表1）。疫木取样时分别取上、中、下部3～5 cm厚的圆盘，用密封袋保存带回实验室。

利用贝尔曼漏斗法分离疫木中的松材线虫后，将线虫液置于15 mL EP管中进行形态学鉴定。挑取鉴定后的松材线虫雌雄成虫30～50条，接入长满灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的PDA平板中，25 ℃下进行恒温培养^[11]。待灰葡萄孢全部被吃完（10 d左右）后，再次使用贝尔曼漏斗法收集松材线虫于15 mL EP管中。后续将EP管3 500 r·min⁻¹离心3 min；去掉上清液，等体积加入0.1%（v/v）硫酸链霉素，摇匀，静置5～10 min，离心，去上清；用无菌水反复洗涤3次后得到纯净的虫株。

使用MolPure Tissue DNA Kit组织DNA提取试剂盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）提取虫株DNA，使用超微量分光光度计UL-5000（上海美析仪器有限公司）检测DNA质量与浓度，DNA质量与浓度合格后进行PCR扩增。采用引物COI-F1（5′-CCTACTATGATT GGTGGTTTTGGTAATTG-3′）与COI-V2（5′-GTAGC AGCAGTAAAATAAGCACG-3′）对样本DNA进行扩增^[12]。反应体系为25 μL，包含2×Hieff^® PCR Master Mix（上海翌圣生物科技股份有限公司）12.5 μL、DNA模板1 μL、浓度10 μmol·L⁻¹的上游和下游引物各1 μL，加ddH₂O补足至25 μL。PCR反应条件为预变性94 ℃，5 min；变性94 ℃，30 s；退火51 ℃，30 s；延伸72 ℃，1 min；循环35次；72 ℃终延伸10 min。产物经1%（v/v）琼脂糖凝胶电泳检测合格后送至上海生工生物工程股份有限公司进行Sanger双向测序。

使用Chromas观察序列峰图，BioEdit拼接序列^[13]。将拼接后的mt COI序列在NCBI（ncbi.nlm.nih.gov）中使用Nucleotide BLAST功能进行序列比对，将比对结果大于99.0%的物种认定为松材线虫，用于后续分析^[14]。使用MEGA（v11）的Alignment中的ClustalW功能对所有序列进行比对和修整^[15]。使用DNAsp（v6.0）进行遗传多样性和遗传分化分析，使用IBM SPSS进行相关性分析^[16]。使用MEGA 11（v11）绘制NJ（Neighbor Joining）系统发育树^[17]。使用Popart绘制单倍型网络图^[18]。

根据遗传多样性系数可知，广西松材线虫基于mt COI基因的变异程度低，表现出低水平的遗传多样性（表2）。广西8个区县67个虫株的松材线虫在647 bp内共存在3个多态性位点，1个简约位点；共发现4种不同的松材线虫单倍型，单倍型多样性总体为0.170；整体核苷酸多样性为0，核苷酸差异系数为0.174。各地区间的遗传距离均小于0.001，表明广西的松材线虫不存在明显的变异（表3）。使用SPSS对各地区的虫株数量与单倍型数量进行线性分析，结果表明随着虫株数的增加，单倍型数与虫株数量不存在相关性（P > 0.05）。

广西8个区县67个虫株的松材线虫共有4个单倍型（表4），其中Hap1出现的频率最高，占所有单倍型的91.0%。而Hap2、Hap3和Hap4出现的频率较低，Hap4占所有单倍型的6.0%，Hap2和Hap3均在本研究中出现1次。进一步地分析广西松材线虫单倍型网络图（图1），发现广西松材线虫以Hap1为中心节点，所有种群均包含了Hap1。同时，以Hap1分化出了3个进化分支，Hap2、Hap3和Hap4分别出现在临桂区、全州县和苍梧县内。

Figure 1.  Haplotype network of B. xylophilus in Guangxi based on mt COI gene

基于mt COI基因构建的松材线虫系统发育树，21 条来自不同地区的松材线虫 mt COI 基因分为两个大支（图2）。来自加拿大与墨西哥的松材线虫聚成一支；来自日本、加拿大、美国以及中国的松材线虫聚成一支，其中，中国广西的松材线虫独聚一支，与国内外其他地区的松材线虫明显区分开来。Hap3与其他3个单倍型具有明显区别（支持率 > 0.95）。

Figure 2.  Phylogenetic tree of B. xylophilus based on mt COI gene

由于松材线虫病带来了巨大的生态危机和经济损失，关于松材线虫的研究在国内一直被高度重视。其中，关于松材线虫群体遗传的研究在1998年就有报道，在接下来的几年内出现了较多以RFLP和RAPD标记法来开展松材线虫种群遗传分化的研究^[19]。Kanzaki等^[20]于2002年采用了ITS标记和mt COI标记对伞滑刃属的线虫进行了聚类分析，明确了mt COI标记对伞滑刃属线虫的适用性。成飞雪等^[21]于2005年开发了松材线虫AFLP标记体系，适用于大多数松材线虫种群的扩增。随着Illumina测序技术的开发，松材线虫种群遗传分化的研究方法得以更新。丁晓磊等^[22]通过Illumina全基因组重测序的方法，分析了来源不同的松材线虫毒力差异。虽然多数研究结果^{[23 − 25]}表明mt COI序列在种内表现出的遗传差异很低，但是依然有大量的研究人员将其用于种内遗传变异的相关研究。本研究基于前人结果，选取了较为简便的mt COI和ITS序列对广西的松材线虫遗传多样性和遗传结构进行了分析，但由于67个虫株的ITS基因一致（本研究并未将其展现出来），结果表明，广西来自8个区县67个松材线虫虫株的单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.170和0.174，未表现出明显的遗传多样性，仅存在着个别位点的变异。这说明广西的松材线虫遗传多样性较少，各个地区间的松材线虫基因交流频繁。

重大外来入侵物种特有的强大定殖能力和适应能力，会在其扩散地点产生始祖效应和遗传漂变，但此现象在松材线虫上并未有明显的表现^{[27 − 28]}。由于松材线虫存在着较多不同的入侵来源，会存在多次入侵现象的发生，因此松材线虫会出现丰富的遗传多样性^[29]。但本研究通过NJ法构建松材线虫mt COI基因系统发育树，发现省域范围内的松材线虫遗传变异程度较小，汇聚成一个分支。与本研究相似，Watanabe和Matsunaga等也在日本不同地区发现了mt COI基因单倍型一致的松材线虫（LC311523、LC316944、AB595191、AB595192），这进一步表明了松材线虫在一定范围内的遗传多样性较低，未发生明显的遗传分化现象。有趣的是，本研究得到的广西松材线虫mt COI基因能够区分于国内外其他地区的松材线虫，特别是能够区分加拿大和墨西哥等北美地区的样本。多数研究认为北美洲是松材线虫的原产地，随着木材的流通扩散至世界各地^[30]。而系统发育树结果表明，4个来自墨西哥和加拿大的松材线虫样本（JF317253、JF317254、AY508068、AY508071）与其他所有松材线虫样本存在着一定的遗传变异。这说明这4个松材线虫样本可能是源于北美的松材线虫本土种群，未发生远距离迁移，从而导致与其他地区的松材线虫存在着明显的遗传分化现象。以上结果均说明了使用mt COI基因对松材线虫进行遗传标记可区分松材线虫的种内变异。随着中国“十三五”和“十四五”规划的有效推进，松材线虫病防控得以落实。积极政策的实施有效地抑制了松材线虫病的远距离传播，因此出现了奠基者效应导致当地的遗传多样性锐减。

广西松材线虫的主要传播媒介松墨天牛（Monochamus alternatus）在野外具有极强的自然扩散能力，成虫最大飞行距离可以达到3.2 km^[31]。因此，松墨天牛的扩散会引起某一种群的松材线虫在一定范围内大规模扩散。基于mt COI基因的单倍型网络图表明，单倍型Hap1在广西67个松材线虫虫株中出现的频率最大，占所有虫株的91%，即Hap1为广西松材线虫的主要单倍型。Hap3与Hap4分别存在于两省交界处的全州县和苍梧县，其中Hap4为苍梧县的主要单倍型，说明苍梧县的松材线虫存在着一定的遗传分化现象。由于松材线虫特有的远距离传播特点，其基因交流往往会无视地理隔离^[32]。但是由于变异程度较小，与广西主要单倍型Hap1仅在一个多态性位点上存在差异，因此本研究团队排除该地存在着较为严重的远距传播现象。因此可推测Hap3与Hap4两种单倍型的松材线虫可能在两省交界处随着自然寄主的繁衍而出现基因交流的现象。后续研究本研究团队可以参考丁晓磊等^[22]的Illumina全基因组重测序技术，对广西4种松材线虫单倍型进行深入分析，进而得出单倍型之间是否存在明显的遗传分化现象。

本研究基于mt COI序列，初步探讨了广西松材线虫的遗传多样性和遗传分化。结果表明广西松材线虫整体遗传多样性较低，并未出现明显的遗传分化现象。通过与国内外其他地区的松材线虫的mt COI序列构建系统发育树，发现广西松材线虫与其他地区明显区分，独成一支。这表明了松材线虫在近年来在广西主要以自然扩散的形式进行传播，未发现明显的外来种群定殖的现象，也侧面反映了广西松材线虫病防控工作和检疫措施在有效性。