Volatile components and antioxidant activity of the extract of longan flowers from Fujian

供试的龙眼花于2022年4月采自福建省泉州市洛江区，经泉州医学高等专科学校黄秀珍教授鉴定为无患子科植物龙眼（Dimocarpus longan）的花。

DXF-20D摇摆式粉碎机（广州市大祥电子机械设备有限公司）；UV-1800PC DS2型紫外可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；KQ5200DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；ME104/02电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）。

1,1二苯基-2-苦基肼/DPPH（上海源叶生物科技有限公司）；无水乙醇、无水甲醇、乙酸乙酯、正丁醇（分析纯 西陇化工股份有限公司）；L（+）-抗坏血酸（西陇科学股份有限公司）；总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒（ABTS法）（上海酶联生物科技有限公司）。

取龙眼花干品1 000 g，粉碎，过4号筛，置于挥发油提取器的圆底烧瓶中，按照1︰5的料液比加入蒸馏水，用电热套缓慢加热至沸腾，提取8 h，得到金黄色油状物即为龙眼花挥发油样品。

色谱柱HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 nm×0.25 μm）；载气为氦气（99.99%）；流速为1.0 mL·min⁻¹；进样量为0.4 μL；分流比为10︰1；进样口温度为250 ℃，程序升温：70 ℃以10 ℃·min⁻¹升温至100 ℃，以2 ℃·min⁻¹升温至120 ℃，保持3 min，以2 ℃·min⁻¹升温至140 ℃，保持3 min，再以10 ℃·min⁻¹升温至终止温度230 ℃，保持3 min。

MS条件：接口温度为280 ℃，电离方式为EI源，电子能量为70 ev，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，倍增器电压为1 741 V，扫描质量范围45～550 m/z，扫描间歇每秒2.94次，溶剂延迟3 min。

采用质谱（MS）比对和保留指数比对（RI）相结合的方法对GC-MS检测到的挥发性成分进行鉴定。将GC-MS分析所得到的各种成分的质谱图与NIST14和NIST11质谱普库进行比对，结合相关文献确定龙眼花挥发性物质的各化学成分。通过峰面积归一化法计算出各化学成分的相对百分含量。

参考《化合物嗅觉阈值汇编》^[14]，检索各化合物的嗅觉阈值，嗅觉阈值包括觉察阈值和识别阈值，觉察阈值指能觉察但不必鉴定或识别出刺激物的最低浓度，识别阈值指能鉴定出或识别出刺激物的最低浓度，本研究采用的均为觉察阈值^[14]。按照以下公式求出各个化合物的气味活度值（OAV）:

式中，C为挥发性化合物的相对百分含量，T为化合物嗅觉阈值。

香气化合物的OAV值越大，说明该化合物对龙眼花香气轮廓的贡献越大。当OAV≥1，说明该化合物可能对香气轮廓有直接影响，定义为关键香气化合物；当0.1<OAV<1，说明该化合物可能对香气轮廓有修饰作用，定义为修饰性香气化合物；当OAV≤0.1，说明该物质对香气轮廓无显著影响，定义为潜在香气化合物^[15]。

龙眼花干品，粉碎过4号筛。分别称取1 g置于5个不同锥形瓶中，以1︰20的料液比分别加入超纯水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和正丁醇，浸泡1 h，超声提取20 min（超声功率200 W，超声温度40 ℃）。待液体冷却后分别用相应的溶剂补足挥发的液体，过滤，得到5个样品溶液分别为水提液（DF-WE）、甲醇提取液（DF-ME）、乙醇提取液（DF-EA）、乙酸乙酯提取液（DF-EAC）和正丁醇提取液（DF-BE）。

分别量取5个不同体积的样品溶液于10 mL容量瓶中，挥干溶剂，再分别加入2 mL DPPH溶液，无水乙醇定容。避光反应1 h，在517 nm波长处测定吸光值，计算DPPH自由基清除率和IC₅₀。阳性对照组用4 g·L⁻¹的抗坏血酸溶液，DPPH用无水乙醇配制成浓度为0.418 g·L⁻¹。

式中，A₀无水乙醇替代样品的吸光度，A₁为样品溶液的吸光度，A₂为无水乙醇代替DPPH的吸光度^[13]。

分别取不同浓度的样品溶液10 μL，按试剂盒说明书操作处理样品，在734 nm处测定吸光值，计算ABTS清除率和IC₅₀，阳性对照用Trolox。

式中，A₀为空白对照组的吸光度，A₁为测定组的吸光度，A₂为对照组的吸光度。

图表绘制和数据处理采用Microsoft Excel软件，方差分析及IC₅₀采用SPSS Statistics 22.0软件处理，结果以均值±标准差表示。

采用GC-MS方法分析，得到龙眼花挥发性成分的总离子流图，共鉴定出59个化合物，占总挥发性成分含量的82.20%。其中，鉴定出烯烃类化合物40个占相对百分含量64.95%，萘类化合物5个占相对百分含量11.12%，烷烃类化合物5个占相对百分含量3.06%，脂肪酸4个占相对百分含量1.17%，同时分别含有醚、醛、醇、酮和酯类各1个。说明龙眼花挥发油中的主要成分是烯烃类化合物，其次是萘和烷烃类化合物（表1）。

通过查阅《化合物嗅觉阈值汇编》^[14]检索这59个化合物的嗅觉阈值，共检索到9个香气化合物（表2）。通过计算香气化合物的OVA值，发现了4个关键香气化合物，3个潜在香气化合物和1个修饰性香气化合物。关键香气化合物分别为石竹烯、茴香脑、邻苯二甲酸二丁酯和正癸酸，其中，石竹烯的OAV值最大，且其香气类型为甜木质香味、丁香味，茴香脑的OVA值次之且具有八角茴香的气味，说明龙眼花的主要香气成分是石竹烯和茴香脑。潜在香气化合物为萜品烯、3-蒈烯和棕榈酸，修饰性香气化合物为二十四烷。

DPPH自由基清除实验结果显示，龙眼花不同溶剂提取液均有一定程度的抗氧化活性，尤其的在样品浓度较高时，抗氧化活性显著（图1～图2）。其中，甲醇提取液的DPPH自由基清除能力最强，IC₅₀为0.021 g·L⁻¹，其次是乙醇提取液和水提液，IC₅₀分别为0.056 g·L⁻¹和0.07 g·L⁻¹，正丁醇和乙酸乙酯提取液的抗氧化活性较弱，IC₅₀分别为0.415 g·L⁻¹和0.947 g·L⁻¹（表3）。

Figure 1.  DPPH free radical scavenging capacity

Figure 2.  DPPH free radical scavenging capability of the positive group

从图3～图4可知，龙眼花不同溶剂提取液对ABTS自由基均有一定程度的清除能力，尤其是水、甲醇和乙醇提取液的抗氧化效果显著。其中，水提取液的ABTS自由基清除能力最好，IC₅₀为0.13 g·L⁻¹，优于阳性对照组的IC₅₀ 值0.15 g·L⁻¹，其次是甲醇和乙醇提取液IC₅₀分别为0.17 g·L⁻¹和0.21 g·L⁻¹，正丁醇提取液的ABTS自由基清除能力也较明显，IC₅₀为2.09 g·L⁻¹，乙酸乙酯提取液的ABTS自由基清除能力不明显（表4）。

Figure 3.  ABTS free radical scavenging capacity

Figure 4.  ABTS free radical scavenging ability of the positive group

本实验通过水蒸气蒸馏法提取闽产龙眼花的挥发油，并通过GC-MS鉴定出59个化合物，其中，石竹烯的相对百分含量最大（16.51%），且其OVA值也最大（11.01），是龙眼花的关键香气化学成分。石竹烯是双环倍半萜型化合物，其具有广泛的药理活性如局部麻醉、消炎、抗癌、抗高血压、镇咳、治疗结肠炎及帕金森症等，同时还可净化空气^[17-18]。相对百分含量占比第2大的是γ-桉叶烯（11.98%），桉叶烯能升高HDL-C（高密度脂蛋白），抗动脉粥样硬化等药理作用^[19]。蛇麻烯（5.65%）是一种单环倍半萜，是许多芳香植物的活性成分，具有抗过敏、抗炎、抗肿瘤、保护胃粘膜等作用^[20]。β-杜松烯（5.43%）也是倍半萜类化合物，现代研究显示，其对植物病原菌具有显著活性^[21]，具有抗氧化活性和体外细胞毒活性等^[22-23]。由此可见，龙眼花挥发油中的主要香气成分具有丰富的药理活性，这些活性物质可以通过呼吸、透皮吸收等方法用于预防和治疗疾病，说明龙眼花挥发油有望开发成芳香疗愈功能产品，在药品和保健品的开发领域具有巨大的潜力。

对龙眼花挥发性成分研究的报道不多^[4,12-13]，广西各地、福州产的龙眼花以及本研究泉州产的龙眼花挥发油中含有共同的化学成分是石竹烯、榄香烯和愈创木烯，这3种化学成分中石竹烯相对百分含量最高。广西玉林和大新产的龙眼花挥发油中相对百分含量最高的是1-甲基-1-乙烯基-2-[1-甲基乙烯基]-4-[1-甲基亚乙基]环己烷，广西龙州产的龙眼花挥发油中相对百分含量最高的是香橙烯，广西岑溪产的龙眼花挥发油中相对百分含量最高的是α-古香油烯^[12-13]，而福建福州和泉州产的龙眼花挥发油中相对百分含量最高的是石竹烯，分别占18.35%和16.51%^[4]。广西各地的龙眼花挥发油中石竹烯的含量在8.77%～15.23%之间^[12-13]。广西各地和福州产的龙眼花挥发油中均检测到大根香叶烯，但是本实验未检测到了该成分。由此可见，不同的产地、生长环境、品种、栽培方法等因素可能导致龙眼花挥发油中的成分及含量差异较大。龙眼的品种，花的采收期以及雌花和雄花的不同，也有可能导致挥发油中成分的差异，需对其进行进一步探究。对不同地区龙眼花挥发性成分的分析为品种选育及栽培方法改良提供一定的科学依据。

抗氧化实验显示，龙眼花提取液具很好的抗氧化活性，尤其是水、甲醇和乙醇提取液的抗氧化活性显著，正丁醇的和乙酸乙酯提取液的抗氧化活性较弱，说明龙眼花的抗氧化活性成分主要为大极性分子。沈宜蓁等^[24-25]对台湾产龙眼花不同提取物中多酚类化合物的含量和抗氧化活性进行测定，发现其抗氧化活性与多酚类化合物的含量成正相关，且从中纯化出2个多酚类化合物表儿茶素和原花青素A2，推测龙眼花的抗氧化活性可能主要归因于其含有丰富的多酚类化合物。

现代研究发现，龙眼花中含有丰富的多酚类、黄酮类、多糖等物质，且具有较强的抗氧化、抗肥胖、降血脂、降血糖和抗肿瘤等活性 ^[9,26-27]。因此，龙眼花在药品、保健品、化妆品、功能性食品等领域具有很大的开发利用价值。