Ploidy identification and genome size analysis of 42 Pitaya germplasm resources

供试的42份种质资源材料取自海南恩红农业科技有限公司的种质资源圃（表1）。对照材料‘金都一号’的基因组大小为1.4 Gb。

用Tris-MgCl₂解离缓冲液作为处理流式细胞样品的处理液,解离缓冲液所需试剂的配制方法如下。1）1 mol·L^-1 Tris-HCl的制备：称取120.11 g Tris,加浓盐酸充分搅拌调节pH至8.0,双蒸水定容至1 000 mL,灭菌,温室保存。2）1 mol·L^-1MgCl₂的制备：称取1.9 g MgCl₂,溶于20 mL双蒸水中,充分搅拌,室温下保存。

将1 mol·L^-1 Tris-HCl（200 mmol·L^-1）,1 mol·L^-1 MgCl₂（4 mmol·L^-1）,TritionX-100（0.5%）按含量混合,使用1 mol·L^-1的HCl将解离缓冲液调节pH至7.5,用0.22 μm的滤膜进行过滤去除杂菌,放置冰箱4 ℃保存备用。

采用Sysmex公司的CyFlow Ploidy Analyser流式细胞仪进行细胞倍性检测。然后用CyFlow Cube（Sysemex公司）软件获取数据,用FlowJo-V10.6.2软件进行结果分析。

（1）取材、预处理：选取健康、幼嫩的火龙果植株茎尖,并利用锋利的刀片去除外围的肉质幼叶,得到火龙果植株的中心茎尖；将解剖得到的火龙果植株茎尖放入0.2%的秋水仙素与0.002 mol·L^-1的8-羟基喹啉混合液中,常温下静置2 h。

（2）前低渗：用蒸馏水清洗2~3次后转入0.075 mol·L^-1的KCl在常温下分别浸泡1.5、2、2.5 h,以确定适宜的前低渗时间。

（3）前固定：将低渗后的茎尖放入卡诺氏固定液（V_无水乙醇∶V_冰醋酸= 3∶1）中,置于4 ℃条件下冷藏固定12 h以上。

（4）解离：用蒸馏水清洗2~3次,将清洗去除卡诺氏固定液后的茎尖放入1 mol·L^-1的HCl中,在常温下分别解离1、1.5、2 h,确定解离时间。

（5）酶解：将解离后的茎尖用蒸馏水清洗2~3次,并放入2.5%的纤维素酶和果胶酶混合液（m_纤维素酶∶m_果胶酶=1∶1）中,在常温下分别处理0.5、1、1.5 h,确定酶解的时间；

（6）后低渗：用蒸馏水清洗2～3次后,放入蒸馏水中分别低渗20、30、40 min,以确定后低渗时间。

（7）后固定：将后低渗的茎尖放入卡诺氏固定液中,在4 ℃下冷藏固定30 min,固定结束后如不能及时进行制片使用,则将茎尖漂洗之后放入75%的酒精中保存（4 ℃）；

（8）染色、制片、观察：将茎尖置于载玻片上,轻轻切取尖端部位2~3 mm,并用锋利的刀将其尽可能的切碎,之后滴加10%改良苯酚品红颜色液,盖上盖玻片,染色20~40 min。染色结束后,用蒸馏水洗去多余染料,并用滤纸吸去多余液体。压片过程中使用带有橡皮的铅笔轻轻敲击盖玻片,使得茎尖组织和细胞可以均匀的分散在载玻片上,最后使用显微镜进行观察拍照。

（1）以已知二倍体材料‘金都一号’为内参,称取约100 mg的火龙果茎组织,去除表面蜡质层,放入预冷的培养皿中,加入预冷的解离缓冲液2 mL,用锋利的刀片竖直快速一次性切碎,整个过程中待测材料需要完全浸没于解离缓冲液中。（2）吸取培养皿中的解离缓冲液,用300目的过滤网过滤到流式细胞仪上机用的试管中。（3）将流式细胞仪的光源波长调节为532 nm,加入100 μL DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染液对细胞核DNA进行荧光标记,立即使用流式细胞仪进行样品检测,每个样品检测3次重复。（4）利用FlowJo-V10.6.2软件进行结果分析,以已知基因组大小的火龙果‘金都一号’为参照样本,计算待测样品的基因组大小（待测样品基因组大小等于参照样本基因组大小乘以待测样品平均荧光强度除以参照样品平均荧光强度）。

研究发现,染色体周围往往附着比较多的细胞质,妨碍染色体的充分铺展,因此为了促使染色体可以更好的分散,笔者采用前将材料经过0.075 mol·L^-1的KCl的处理,来利用细胞内外渗透压的不同,使细胞经过吸收充分膨胀,从而获得染色体分散更加良好的细胞。从图1可以看出,茎尖经过前低渗1.5 h后染色体聚集,不易分散；前低渗2 h后,染色体可以很好的分散；经过前低渗2.5 h的处理后,发现低渗时间过长会导致染色体出现损伤。

Figure 1.  The effects of microscopical preparation by different pre-hypotonic treatment times

解离的目的是为了更好的使细胞分离,材料软化易于制片以及单细胞的观察。从图2可知,当解离时间为1 h时,火龙果茎尖细胞解离不充分,在进行制片时细胞难以压散,且容易造成气泡残留,难以进行观察。当解离时间为2 h时,细胞易于分散,但由于解离时间过长,造成细胞破裂或者染色体出现断裂的现象。当解离时间为1.5 h时,细胞易于分散,没有出现重叠的现象,且染色体完好,背景清晰,易于观察和计数,适合用于核型分析。

Figure 2.  The effect of microscopical preparation by different dissociation times

观察中发现,火龙果茎尖存在大量果胶,并且火龙果茎尖中心部位属于木质部,细胞壁较厚不易于破除,因此在试验过程中使用纤维素酶和果胶酶混合液对火龙果茎尖进行处理。如图3所示,在酶解时间为0.5 h时,材料趋于硬化,并且存在果胶的残留,对制片过程造成了一定阻碍,且镜检后发现细胞存在重叠,不易于染色体的观察与计数。当酶解1.5 h时,在材料处理过程中容易在成断裂,从而遗失制片所需要的尖端部位,同时经过制片后观察发现,虽然可以得到单个细胞而且方便观察染色体,但是由于酶解时间过长造成细胞壁溶解消失,无法观测到细胞边界。当酶解时间为1 h时,材料的制备过程中硬度适中不容易断裂,制片时也可以获得分散的细胞,且细胞壁没有破裂的现象,可以更容易分辨出单细胞,适合用于核型分析。

Figure 3.  The effect of microscopical preparation by different enzymatic hydrolysis times

后低渗的目的是为了使细胞吸水膨胀,从而使染色体更加的分散,但是为了防止细胞过度吸水,导致细胞涨破,所以仍需要确定后低渗的合适时间。从图4中可以发现,火龙果茎尖经过后低渗20 min,染色体依然存在较为集中,出现缠绕、重叠等现象,对后续的核型分析造成影响。当后低渗时间为40 min时,细胞吸水涨破,容易造成染色体缺失。当后低渗时间为30 min时,染色体分散程度较好,且细胞完整,易于后续的计数与计算,适用于核型分析。

Figure 4.  The effect of microscopical preparation by different post-hypotonic treatment times

本实验以已经确定的火龙果二倍体材料‘金都一号’为参照品种材料,对其茎尖、幼嫩茎条、老熟茎条进行检测,选取优质的实验材料。从图5可知,茎尖的流式细胞检测有良好的二倍体单峰。而幼嫩茎条与老熟茎条则有3个峰值,且相对于幼嫩茎条,老熟茎条则有更多的八倍体细胞。同时,在检测过程中发现幼嫩茎条和老熟茎条的杂质较多,导致获得有效的细胞核数降低。

Figure 5.  Flow cytometry assays for different tissues of pitaya

幼嫩茎条和老熟茎条相比,老熟茎条的八倍体细胞对应峰值比四倍体细胞对应峰值高,因此在进行倍性鉴定时,老熟茎条容易造成判断错误。幼嫩茎条的四倍体细胞对应的峰值比二倍体细胞对应的峰值高。在火龙果流式细胞技术的检测上,茎尖最适宜作为试验材料,其次是幼嫩茎条,老熟茎条不适合作为火龙果流式细胞检测材料。

以已知的二倍体‘金都一号’（2n=2x=22）为对照材料,对42份火龙果种质资源进行流式细胞倍性鉴定,测得‘金都一号’染色体的峰值荧光强度为5 121,其具有良好的二倍体单峰；四倍体品种染色体的峰值荧光强度在2倍的二倍体荧光强度处有较好的单峰,且四倍体品种的DNA相对含量也是二倍体含量的2倍（图6）。

Figure 6.  the comparison between diploid and tetraploid cells of pitaya

经流式细胞检测收集的42份火龙果种质资源的染色体倍性见表2。其中,有41份荧光强度值在4 219~6 612之间,呈二倍体荧光强度（0.82~1.29）,为二倍体材料；1份荧光强度值为10 939,是2.14倍的二倍体的荧光强度值,为四倍体材料。四倍体材料为‘燕窝果’。在42份火龙果种质资源材料中并未发现三倍体材料。

根据植物基因组的1C值大小,将基因组分成5类。以‘金都一号’为对照,对其余41种火龙果基因组大小进行预估,发现预估基因组大小在1.15~2.99 Gb之间（表2）,预估基因组的平均大小为1.45 Gb,其中有15份火龙果种质资源的1C≤1.34 Gb,属于极小型基因组；其余27份火龙果种质资源的1C值在1.35 Gb~3.34 Gb之间,属于小型基因组。42份火龙果种质资源的预估基因组大小主要集中在1.35~3.34 Gb之间,其次在1.15~1.34 Gb之间,并未发现其他种类的基因组,其中‘蜜宝’的基因组最小,仅有1.15 Gb；‘燕窝果’的基因组最大,达到了2.99 Gb。两者的预估基因组大小相差2.6倍。

在对火龙果染色体制片材料的选择中发现火龙果根系多为须根系,根系较细且木质化严重,不易切割制片；火龙果枝条的气生根相对较粗且质地柔软,方便制片,但火龙果气生根并没有稳定的催生技术,获取不易。本研究为建立方便、快捷、稳定的火龙果制片技术体系,以火龙果茎尖为材料进行火龙果染色体制片。本研究发现,火龙果茎尖染色体制片在前低渗时间为2 h；解离时间为1.5 h；酶解时间为1 h；后低渗时间为30 min时,染色体分散程度较好,背景清晰,没有出现重叠的现象,具有完整的细胞。

流式细胞技术在植物倍性鉴定方面具有操作简单、效率高、结果准确的特点^[13]。为了获得准确的倍性鉴定结果,样品的选择是其中的关键。本试验对火龙果流式细胞检测的材料进行筛选比较,发现幼芽茎尖具有较好的二倍体荧光图像。幼嫩茎条与老熟茎条都存才较多的杂峰,且细胞核数显著降低,存在较多的四倍体细胞和八倍体细胞,影响流式细胞检测的准确性。

在种质资源评价中,染色体的倍性鉴定是其中重要的环节,染色体的倍性鉴定对新品种选育及品种资源的科学利用具有重要意义^[14]。本研究利用染色体制片技术和流式细胞技术,同时对42份火龙果种质资源进行倍性鉴定,取得一致性的研究结果,其中41份种质资源为二倍体（2n=2x=22）材料,1份四倍体（2n=4x=44）材料,未发现三倍体种质资源。42份火龙果种质资源中仅有1份四倍体材料,预估基因组大小为‘燕窝果’（2.99 Gb）。所有二倍体材料中‘细致’的预估基因组最大,大小为1.81 Gb；‘蜜宝’的预估基因组最小,为1.15 Gb。

随着火龙果产业的发展,火龙果优质新品种的选育显得尤为重要。本研究利用茎尖染色体制片技术和流式细胞技术,对42份火龙果种质资源进行倍性鉴定以及基因组大小研究,既能为培育优质火龙果品种和开展人工授粉杂交、转基因等工作提供参考,也能为火龙果的全基因组测序以及细胞遗传学研究提供依据。