Genome-wide identification and expression analysis of GRF gene family in litchi

从荔枝基因组数据库（http://www.sapindaceae.com/ ）META SEARCH工具搜索Growth-regulating factor，搜索注释为Growth-regulating factor基因，进一步通过NCBI Conserved Domains Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）对搜索到的基因序列是否含有保守QLQ（ PF08880）和WRC（ PF08879）结构域进行蛋白结构域验证，利用在线生物信息学软件Expasy Protoparam （https://web.expasy.org/protparam/）、SignaIP 3.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）、TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、Plant-mPLoc Server在线软件（ http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）分别预测荔枝GRF蛋白长度、分子质量、等电点、不稳定系数、信号肽、跨膜结构和蛋白亚细胞定位情况。

从荔枝基因组注释文件中提取荔枝GRF基因家族成员在染色体上的物理位置信息，利用MapInspect软件将GRF 基因定位到对应的染色体。方便起见，根据在1～15号染色体上的先后顺序统一编号为LcGRF1～LcGRF12。

从荔枝基因组数据库中提取GRF的CDS序列与基因组DNA 序列，利用GSDS 分析GRF基因家族的基因的结构，包括内含子、外显子的数目。

拟南芥和水稻GRF 蛋白序列由NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载获得。采用MEGA 6.0 软件自带的ClustalW 以默认参数对拟南芥、水稻和荔枝GRF 蛋白进行多重序列比对，通过邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树，参数设置：bootstraps重复次数1 000，泊松模型，部分删除gap。

利用MEME（http://memesuite.org/tools/meme）分析LcGRFs 蛋白保守基序。参数设置：基序的最大数目设置为10, 基序长度设为6～150 个氨基酸，其他参数为默认值。

利用荔枝基因组数据库提取LcGRF基因上游2 000 bp 的启动子序列，通过PlantCare（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线查找启动子区的顺式作用元件。

利用荔枝基因组网站的荔枝时空表达的转录组数据对LcGRF基因家族在不同组织器官中的时空表达进行分析，转录数据包括12个不同组织（果柄、果肉、种子、果皮、子房、败育雄蕊、叶片、雄蕊、雌蕊、雌花、雄花、幼果），利用TBtools软件绘制表达热图。

所有的GRF蛋白的都包含一个高度保守的WRC和QLQ结构域。本研究鉴定荔枝基因组中的GRF基因家族成员，首先通过荔枝基因组网站的META SEARCH工具搜索Growth-regulating factor，共搜索到22个注释为Growth-regulating factor基因，进一步通过NCBI Conserved Domains Search对22个基因序列是否含有保守QLQ（ PF08880）和WRC（ PF08879）结构域，最终筛选荔枝基因组中的12个GRF基因家族成员，为了方便起见，根据出现在染色体上的位置顺序从小到大重新命名为LcGRF1～LcGRF12。

预测的荔枝GRF家族成员编码的氨基酸长度范围在210～605 aa 之间，蛋白分子质量介于22969.07～65043.08 Da之间，等电点介于6.87～9.58，不稳定系数介于39.63～60.93。LcGRF9不稳定指数为39.63，为稳定性蛋白，其余的不稳定指数均大于40，为不稳定蛋白。12个LcGRF家族成员均为无信号肽的亲水蛋白，有且仅有LcGRF11 具有1 个跨膜结构。亚细胞定位预测结果显示，所有LcGRFs 均定位于细胞核（表1）。这意味着LcGRF家族具有相对保守的生物学功能。

荔枝GRF基因在染色体位置作图，根据荔枝GRF基因在染色体位置的信息，并利用MapInspect工具进行染色体定位作图。结果显示12个GRF基因定位在除5、7、9、13和14 号染色体外的10条染色体上，每条染色体上GRF基因的数目分布不均衡。其中2号和9号染色体分别含有2个GRF基因，其余的染色体均含有1个GRF基因（图1）。说明LcGRF家族成员各自具有不同的表达调控模式，其中LcGRF2和LcGRF3为串联复制，推测其具有相似的生物学功能。

通过利用GSDS在线基因结构作图软件，将荔枝GRF基因家族成员的基因组DNA序列和CDS序列提交GSDS站点，作基因结构图。结果表明，所有的GRF基因至少还有2个内含子，该家族内含子的数量变化在2～5范围内，其中有6个LcGRF基因家族成员含有3个内含子，4个GRF基因家族成员含有2个内含子，LcGRF11内含子数量最多，含有5个内含子，其次为LcGRF12含有4个内含子（图2）。说明LcGRF家族成员具有相似的序列和功能特征，但在进化过程中因发生突变在结构上面具有一定的变异性和多样性。

为了进一步了解荔枝GRF基因家族成员之间的进化关系，分别利用模式植物拟南芥中9个GRF基因家族成员和水稻中12个GRF基因家族成员同荔枝中12个GRF基因家族成员构建进化树（图3），利用MEGA6.0构建NJ树，结果表明荔枝中12个GRF分为5个亚家族，其中LcGRF1、LcGRF5、LcGRF6和LcGRF11位于亚家族Ⅰ，LcGRF4和LcGRF9位于亚家族Ⅱ，LcGRF12位于亚家族Ⅲ，LcGRF2、LcGRF3和LcGRF8位于亚家族Ⅳ，LcGRF7和LcGRF10位于亚家族Ⅴ。系统进化关系表明LcGRF基因家族与AtGRF基因家族亲缘关系较近，推测存在相似的生物学功能，有助于进一步了解LcGRF基因家族成员在荔枝生长发育的生物学功能。

保守基序分析结果显示，LcGRF家族所有成员均含有典型的保守基序motif 1（WRC）和motif 2（QLQ）（图4）。位于LcGRF7和LcGRF10含有相同的保守基序，且含有的motif最多，共有7个保守基序（motif1、motif2、motif5、motif7、motif8、motif9和motif10）；其次为LcGRF1含有6个保守基序（motif1、motif2、motif5、motif7、motif9和motif10）；LcGRF2、LcGRF3、LcGRF5和LcGRF12含有5个保守基序，其中LcGRF2和LcGRF3含有5个相同的蛋白保守基序（motif1、motif2、motif3、motif4和motif6），LcGRF5的保守基序为motif1、motif2、motif5、motif9和motif10，LcGRF12的保守基序为motif1、motif2、motif5、motif7和motif10；LcGRF6和LcGRF11分别含有4个保守基序，LcGRF4、LcGRF8和LcGRF9分别含有3个保守基序。根据进化分析表明，位于相同亚家族的保守基序相近，如位于亚家族Ⅴ的LcGRF7和LcGRF10含有的保守基序相同，位于亚家族Ⅳ的LcGRF2和LcGRF3含有的保守基序相同，位于亚家族Ⅱ的LcGRF4和LcGRF9含有的保守基序相同。因此，推测位于相同家族的成员具有相似的生物学功能。

为了分析LcGRF基因对各种反应的潜在功能，通过PlantCare进一步分析了LcGRF基因启动子区中的顺式元件。启动子顺式元件分析结果如图5所示，除去核心启动子区域的TATA-box和CAAT-box及未知功能的原件，共发现有245个顺式作用原件。其中光响应原件有112个，占45.71%，包含有Box4、I-box、AE-box、G-box、TCT-motif、GA-motif、GATA-motif、GT1-motif、AT1-motif、ATCT-motif、TCCC-motif、MRE等，所有LcGRF基因均含有光响应原件，LcGRF11含有的光响应原件数量最多，有16个；其次为LcGRF4含有12个光响应原件；LcGRF5、LcGRF8、LcGRF9和LcGRF10含有10个光响应原件，LcGRF1含有的光响应原件最少，为5个。植物激素响应原件有71个，占28.98%，植物激素相关的顺式元件包括脱落酸响应原件（ABRE）、茉莉酸响应原件（CGTCA-motif和TGACG-motif）、水杨酸响应原件（TCA-element和SARE）、赤霉素响应原件（GARE-motif、TATC-box和P-box）、生长素响应原件（TGA-box、TGA-element），LcGRF11含有的植物激素响应原件数量最多，多达12个；LcGRF2、LcGRF6和LcGRF10含有的植物激素响应原件数量最少，仅含有2个。非生物胁迫响应原件有46个，占18.78%；包括厌氧诱导原件ARE、低温响应原件LTR、干旱诱导原件MBS、防御和应激响应原件TC-rich repeats；LcGRF3和LcGRF7含有非生物胁迫响应原件最多，有7个；LcGRF5和LcGRF6含有非生物胁迫响应原件最少，只有1个。生长发育相关原件有16个，占6.53%；植物生长发育相关原件包括CAT-box、GCN4_motif、HD-Zip 1、MBSI、MSA-like、O2-site、RY-element等；LcGRF7含有4个植物生长发育相关原件，LcGRF1、LcGRF4、LcGRF9、LcGRF10LcGRF12，LcGRF6和LcGRF11含有1个植物生长发育相关原件，LcGRF2、LcGRF3、LcGRF5和LcGRF8不含有植物生长发育相关原件。说明荔枝LcGRF成员参与不同生物学功能，如荔枝的光响应、激素响应、生长发育与胁迫响应等相关过程。

利用荔枝基因组网站的荔枝时空表达的转录组数据对LcGRF基因家族在不同组织器官中的时空表达进行分析，分析12个不同组织（果柄、果肉、种子、果皮、子房、败育雄蕊、叶片、雄蕊、雌蕊、雌花、雄花、幼果）中LcGRF基因的表达情况，利用TBtools 软件绘制热图，结果（图6）显示，不是所有的LcGRF基因家族成员在不同组织都有表达，且不同组织中的表达量也存在明显的差异。如LcGRF2在雄蕊、果肉、子房、败育雄蕊中未检测到表达，LcGRF3在雄蕊和败育雄蕊中未检测到表达，LcGRF5在叶片、果柄、幼果、雄花、雄蕊和败育雄蕊中未检测到表达，LcGRF8在果肉中未检测到表达，LcGRF9在雄蕊和果肉中未检测到表达。LcGRF基因家族成员在雌蕊、雌花和种子中均有表达且表达量相对其他组织较高，但不同家族成员间的表达量存在差异。LcGRF基因家族成员在败育雄蕊、雄蕊、雄花、果柄、幼果、果肉、果皮、叶片中的表达量相对较低。12个LcGRF基因家族成员除了LcGRF5和LcGRF7外，其余10个LcGRF基因家族成员在雌蕊中的表达量均最高，其中LcGRF1在雌蕊中的表达量最高；以上LcGRF基因家族成员在雌花中的表达量也相对较高。LcGRF7在种子、果皮、败育雄蕊和雄花中的表达量均比其他家族成员表达量高。因此，推测LcGRF不同成员可能在荔枝不同生长发育过程中发挥调控作用，参与调节荔枝的生长发育。

随着植物基因组研究的深入，利用比较基因组学研究策略，通过广泛的基因家族分析，奠定基因功能研究的基础，现已成为基因功能研究的热点^[14]。GRF基因首先从水稻中鉴定出来^[2]。近年来, 随着大规模的植物基因组测序, 大量GRF基因被分离、鉴定。目前，在拟南芥^[5]、水稻^[4]、玉米^[6]、番茄^[7]、葡萄^[8]、香蕉^[9]、龙眼^[9]、桃^[11]、甜瓜^[11]分别发现了9、12、14、13、8、20、9、10和7个GRF家族成员。本研究利用生物信息学方法，经全基因组鉴定，一共获得12个LcGRF基因，并对其理化性质、基因结构、系统进化、蛋白保守结构域、顺式作用元件、不同组织器官表达进行了系统分析。理化性质分析发现，大部分LcGRF 是碱性不稳定蛋白，且均为亲水蛋白，这与芝麻^[15]中GRF 蛋白特征研究结果相似。系统进化分析发现，荔枝、拟南芥和水稻的GRF 蛋白可分为5 个亚族，这与其他植物如香蕉^[15]和芝麻^[15]的结果分类一致。同一亚族内的大多数LcGRF基因结构、蛋白保守基序分布模式相似，这与其他物种中如香蕉^[9]的研究结果一致。顺式作用元件往往可以预测其在植物生长发育和环境胁迫适应过程的重要作用。分析发现，所有LcGRF基因的启动子均包含光响应、植物激素响应以及非生物胁迫响应相关元件，暗示了LcGRF基因的表达可能主要受到光照、激素的调节并且在荔枝逆境胁迫响应中同样扮演重要角色。

荔枝不同组织器官转录组数据分析显示，LcGRF基因家族成员间在不同组织器官的表达量存在较大差异。LcGRF基因家族成员在雌蕊、雌花和种子中均有表达且表达量相对其他组织较高，10个LcGRF基因家族成员在雌蕊中的表达量均最高，这种时空表达的差异性预示着LcGRF基因可能在调控特定组织器官的生长发育中具有重要的作用。

本研究通过全基因组鉴定在荔枝基因组中鉴定获得12个LcGRF基因家族成员，进一步的系统进化分析表明LcGRF可划分为5个亚家族。LcGRFs启动子上存在大量的光、植物激素、非生物胁迫响应以及生长发育相关的顺式作用元件。LcGRF基因家族成员时空表达表现出多样化的表达特征，表明不同成员可能在荔枝不同生长发育过程中发挥调控作用，参与调节荔枝的生长发育，但相关分子调控机理仍需要进一步研究。