Effects of rice-soybean-rice rotation on soil physicochemical properties and microbial community

试验地为海南省东方市农乐南繁科技有限公司田间实验基地（18°87′ N，108°70′E），属热带季风海洋性气候，年平均降水量为950 mm，年平均蒸发量2 300 mm，土壤类型为水稻土。试验布置前耕层土壤基础理化性质为pH 5.4，土壤全氮0.43 g·kg⁻¹，有机质1.34 %，有效磷28.51 mg·kg⁻¹、速效钾84.98 mg·kg⁻¹。

试验开始于2021年7月，试验共设2个处理：水稻连作（稻-稻-稻）处理（RRR）和水稻-大豆-水稻轮作（稻-豆-稻）处理（RSR）；每个处理4次重复，共8个小区。水稻季氮、磷、钾肥用量分别为180、90、120 kg·hm⁻²，磷肥和钾肥作为底肥一次性施入，氮肥分别在播前、分蘖期、抽穗期按比例40∶35∶25施入；大豆季氮、磷、钾肥用量为150、150 、150 kg·hm⁻² 。

供试水稻品种为‘寿乡一号’，大豆品种为‘闽豆64’，由海南农乐南繁科技有限公司提供。水稻连作播种日期：2021年7—11月；收获日期：2022年2—6月、2022年8—11月；水稻播种量为45 kg·hm⁻²，株行距为25 cm×25 cm。稻豆轮作播种日期：2021年7—11月，收获日期：2021年12月—2022年3月、2022年8—11月；水稻播种量为90 kg·hm⁻²，株行距为20 cm×25 cm，播种深度为5 cm。试验周期为1 a，栽培和植保等田间管理与农户保持一致。

采用5点取样法采集RRR和RSR处理种植前后0～30 cm耕层土壤，过2 mm筛并将土壤样品分为3个部分，一部分保存于−80 ℃冰箱中，用于测定微生物多样性；一部分存于4 ℃冰箱中，用于测定土壤微生物量碳氮及有机碳组分；剩余部分风干，用于测定土壤理化性质及土壤团聚体。

土壤微生物生物量碳采用氯仿熏蒸-K₂SO₄浸提法测定^[15]；水溶性碳（WSC）和热水可氧化碳（HWEC）含量采用振荡浸提分光光度法测定^[16]；测土壤pH时按土水质量比1∶2.5配样，pH计测定^[17]；土壤有机碳采用外加热重铬酸钾氧化法容量测定；全氮用凯氏定氮法测定；有效磷采用0.5 mol·L⁻¹碳酸氢钠法测定；速效钾采用中性乙酸浸提法测定^[18]；土壤团聚体稳定性采用湿筛法测定^[19]。

根据DNeasy Power Soil Kit（QIAGEN）试剂盒说明书对土壤总DNA进行提取，利用Novaseq 6000 PE250平台对提取的DNA质量浓度和纯度进行检测；对细菌16S rDNA V4+V5区和真菌ITS1F和2R区域进行扩增。对构建好的文库进行检验、测序。对测序结果进行操作单位聚类与分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析及不同分类水平的群落结构分析。

于2021−11−08、2022−03−15、2022−11−25测定RRR和RSR处理水稻成熟期的产量。植株全氮含量采用凯氏定氮法测定^[18]，并计算周年产量、吸氮量和氮肥利用率。计算如下：（1）产量=每季产量之和；（2）吸氮量=每季（秸秆+籽粒）含氮量×产量；（3）氮肥利用率=吸氮量×氮肥投入量。

采用Excel 2016和IBM SPSS 23.0软件对数据进行统计分析，采用单因素（one-way ANOVA）进行方差分析，Duncan法进行多重比较（P<0.05），利用软件Origin Pro 2021作图。图标中数据为平均值±标准差。

如表1所示， RRR处理与RSR处理相比，水稻周年产量、周年吸氮量、氮素利用效率和下季水稻产量产生了显著变化。RSR处理的周年产量为7869.2 kg·hm⁻²，与RRR处理相比降低了17.3%。RSR处理周年吸氮量为274.2 kg·hm⁻²，氮素利用率为83.1%，与RRR处理相比分别显著提高了56.2%和70.3%。RSR处理的第二季水稻产量为5865.4 kg·hm⁻²，与RRR处理相比提高了23.5%。

如表2所示，与RRR处理相比，RSR处理土壤理化性质产生了显著变化。RSR处理土壤的全氮含量为0.57 g·kg⁻¹，有效磷含量为38.4 mg·kg⁻¹，与RRR处理相比分别显著提高了16.6%和12.6%。土壤速效钾和有机质含量为109.1 mg·kg⁻¹和15.7 g·kg⁻¹，与RRR处理相比分别显著提高了14.3%和26.6%。RSR处理土壤pH为5.14，与RRR处理相比降低了0.51。

土壤团聚体作为土壤的基本结构之一，其组成和稳定性影响土壤养分在团聚体中的分布。不同粒级团聚体的组成是鉴定土壤肥力状况的指标之一。土壤团聚体的组成主要受不同粒径分布和轮作模式影响。如表3所示，轮作处理土壤水稳性平均质量直径（MWD）和几何平均直径为0.32 和0.906 mm，与RRR处理相比，上升了0.01 和下降了0.001 mm，大团聚体比例（ R >0.25）为0.24 mm，下降了0.01 mm。

土壤碳组分能直观反映土壤碳动态，常与养分循环、团聚体稳定性等土壤功能联系在一起。同时土壤碳组分也是土壤健康的重要组成部分，与土壤养分有效性及微生物活性密切相关。土壤碳组分中除土壤有机碳（SOC）外，微生物生物量碳（MBC）、热水可提取碳（HWEC）、水溶性碳（WSC）也是碳组分的重要组成部分，是反映土壤健康的重要指标。如表4所示，RRR处理与RSR处理相比，土壤有机碳组分产生了显著性变化。RSR处理的热水可提取碳（HWEC）、水溶性碳（WSC）含量分别为43.7、10.3 mg·kg⁻¹，与RRR处理相比分别显著提高了35.7%和18.9%。RSR处理微生物生物量碳（MBC）和土壤有机碳（SOC）的含量分别为34.8 和1.79 g·kg⁻¹，与RRR处理相比，显著提高38%和26.9%。

Ace值是用来估计群落中含有OTU数目的指数，使用Chao1算法估算群落中所含OTU数目，其中Ace和Chao1的数值越大代表样本中所含物种越多；Shannon和Simpson指数用于评估样本中物种组成的多样性，数值越大代表该环境中的多样性越高。如表5所示，RRR处理与RSR处理相比，土壤微生物丰度和多样性产生了显著性变化。RSR处理下土壤细菌的ACE指数、Chao1指数和Shannon指数，与RRR处理相比，分别显著提高了40.2%、40.3%、5.7%，对Simpson指数则无显著影响。RSR处理与RRR处理相比，土壤真菌Shannon指数和Simpson指数，显著提高了20.1%和16.5%。稻豆轮作没有对土壤真菌Ace指数和Chao1指数产生显著性影响。

不同耕作条件下土壤共有11个优势细菌属（选取相对丰度前10位，其他属为other）。如图1-a所示，土壤细菌属水平的群落结构基本一致。其中，轮作处理下的优势细菌属为Koribacter菌属（平均相对丰度为1.7%）、红游动菌属（Rhodoplanes 平均相对丰度为1.3%）、硫杆菌（Thiobacillus 平均相对丰度为1.6%）、戴氏菌属（Dyella 平均相对丰度为1.9%），这4个优势菌属累计相对丰度为6.5%。与RRR处理相比，RSR处理Koribacter菌属、红游动菌属（Rhodoplanes）、硫杆菌属（Thiobacillus）、戴氏菌属（Dyella）的相对丰度分别显著提高了35.4%、91.4%、161.8%、275.5%，Anaerolinea菌属的相对丰度显著降低了69.9%。

不同耕作条件下土壤共有11个优势真菌属（选取相对丰度前10位，其他属other）。如图1-b所示，土壤真菌属水平的群落结构基本一致。 其中，轮作处理下的优势真菌属为小被孢霉属（Mortierella 平均相对丰度1.5%）、柄孢壳属（Zopfiella 平均相对丰度3.5%）、镰刀菌属（Fusarium 平均相对丰度1%）、Apiosordaria属（Apiosordaria 平均相对丰度1.5%），这4个优势菌属累计相对丰度为1.9%。与RRR处理相比，RSR处理小被孢霉属（Mortierella）、柄孢壳属（Zopfiella）、镰刀菌属（Fusarium）、Apiosordaria属的相对丰度分别提高了690.6%、428.7%、398.4%、11.3%。Westerdykella菌属和伪硫杆菌 （Pseudothielavia）的相对丰度分别显著降低31.9%和57.4%。

采用基于Bray-Curtis距离矩阵的主坐标分析（PCoA）来分析不同处理下的土壤细菌群落结构差异。PCoA结果的分析表明（图2-a），前2个主成分解释了84.1%的细菌群落变异；结合PERMANOVA分析结果表明，不同耕作模式下细菌OTU数目在两轴间存在显著差异，说明RSR处理对土壤细菌群落结构产生了显著性影响。PCoA结果的分析表明（图2-b），前2个主成分解释了72.9%的真菌群落变异；结合PERMANOVA分析的结果表明，不同耕作措施下真菌OTU数目在两轴间存在显著差异，说明RSR处理对土壤真菌群落结构产生了显著性影响。

土壤细菌群落（图3）与土壤速效钾（r=0.49）、有机质（r=0.19）、HWEC （r=0.25）、MBC （r=0.33）呈显著相关性（P<0.05）。说明土壤速效钾、有机质、HWEC和MBC对土壤细菌产生了显著影响，而与土壤全氮、有效磷、pH、WSC、MWD、产量无明显差异（P>0.05）。这说明土壤细菌主要受土壤速效钾、有机质、HWEC、MBC指标变化而改变。

土壤真菌群落（图3）与土壤速效钾（r=0.60）、有机质（r=0.56）、HWEC（r=0.58）呈显著相关性（P<0.05），与MBC（r=0.59）呈极显著相关性（P<0.01）。这说明土壤真菌群落主要会随着土壤速效钾、有机质、HWEC和MBC的变化而发生改变。

土壤养分含量和作物产量是衡量土壤能否可持续生产的主要指标，而土壤养分是提高轮作系统生物量的主要因素^[20-21]。与水稻连作相比，RSR处理水稻周年产量下降了17.3%。RSR处理周年吸氮量和氮素利用率，与RRR相比提高了56.2%和70.3%。RSR处理第二季水稻产量，与RRR处理相比提高了23.5%。因为轮作处理中大豆的单产较低，从而使轮作周年产量下降，而同时大豆籽粒含氮量较高，使RSR处理周年氮产量得到提高。轮作影响土壤团粒结构，改善了土壤养分供给能力，促进植株的干物质积累与营养元素含量，从而提高了下茬水稻产量^[21-23]。

本研究结果表明，稻豆轮作后pH降低了0.51，这是因为大豆根系分泌物中的大量有机酸分子能够增加土壤中的H⁺，使根际土壤酸化，从而改变了土壤的pH^[24]。此外，稻豆轮作增加了土壤氮、有效磷、速效钾的含量。这是由于轮作改变了土壤微生物群落结构与多样性，使得土壤胶结物质所固定的养分元素在微生物的介导下得到释放，提高了土壤养分的有效性^[25-26]。

土壤团聚体是土壤结构的基础，土壤团聚体平均质量直径、几何平均直径和大团聚体比例是表示土壤团聚体稳定性的关键指标，它们的值越高，表征土壤团聚度越好，团聚体结构越稳定^[19,25]。轮作下土壤微团聚体比例没有显著变化，虽然轮作促进了土壤微生物、植物等生物因素的变化，但由于轮作时间较短，对土壤团聚体没有产生显著影响^[26]。

本研究结果表明，稻豆轮作使HWEC、WSC、MBC和SOC含量分别显著提高了35.7%、18.9%、38%和26.9%。众多研究指出，种植制度和耕作栽培方式的不同，轮作明显提高了土壤中有机碳，增加了氮素供应来提高微生物对其利用率，也可能因为激发效应降低土壤碳组分含量，从而改变土壤中有机碳组分，这与前人研究结果一致^[27-29]。

微生物是土壤与作物根际养分转化的主要过程之一^[5]，它生长所需要的营养元素和碳源来自于土壤，同时微生物又能够分解土壤中的有机碳/氮，使土壤碳/氮含量提高^[30]。本研究结果表明，稻豆轮作提高了土壤细菌和真菌的丰富度与多样性。轮作通过改变微生物群落结构，从而影响了土壤的养分形态及产量^[31]。细菌和真菌PCoA分析的结果表明，水稻连作和稻豆轮作后土壤OTU数目存在显著性差异，说明稻豆轮作显著影响土壤微生物群落结构，与张河庆等^[32]的研究结果一致。一方面轮作改变了土壤微生物的生态系统，另一方面不同作物类型释放的根系分泌物，改变了土壤的环境条件，从而对土壤微生物物种和丰度产生影响，改变了土壤微生物群落的结构^[5,33]。

随着轮作的进行，土壤理化指标会随着细菌群落的改变而发生变化。一方面，水旱轮作改善了土壤通气性；另一方面不同作物的根系分泌物改变了土壤的环境条件，进而对微生物活性产生了影响，间接提高土壤养分和有机碳含量，从而使土壤细菌群落也发生了改变。土壤真菌主要可以分解土壤中的植物残体和纤维素、半木纤维素、木质素等难降解有机物，在降解过程中释放养分，促进植物生长，进而影响土壤真菌^[34]。土壤真菌群落对土壤全氮、有效磷、pH、WSC、MWD、产量无明显差异（P>0.05），这可能是不同作物对土壤的利用方式和对土壤性质需求不同所致^[31,35]。

稻豆轮作能够显著提高土壤全氮、有效磷、速效钾、HWEC、SOC等，对土壤WSC和MBC影响不显著；此外稻豆轮作能够显著提高土壤细菌和真菌的丰富度、多样性与群落结构。不同耕作措施的土壤细菌和真菌的群落组成具有较大差异，说明不同耕作模式能够对土壤细菌和真菌群落组成有显著影响。土壤细菌和真菌群落主要与土壤速效钾、有机质、HWEC、MBC （P<0.01）有关。这说明稻豆轮作通过影响植物和微生物的生长代谢，使土壤养分含量和土壤微生物发生改变。本研究结果有助于理解稻豆轮作下土壤理化性质与土壤微生物群落的变化，为不同耕作模式的实际应用提供理论支撑，然而关于稻豆轮作的遗留效应还有待进一步研究。