Identification of catechols and their protecting groups usin gcolor reactions

六水合三氯化铁、氯化亚铁、氯化铜、六水合三氯化铝、L-DOPA（1）、苯酚（2）、对苯二酚（3）、间苯二酚（4）、儿茶酚（5）、多巴胺、连苯三酚（6）、3,4-（亚甲二氧）肉桂酸（11）、水杨酸（17）、乙酰水杨酸（18）、丹皮酚（19）、麦芽酚（20）、桑黄素（21）、2-（3,4-二甲氧基苯基）乙胺（26）、3,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯（27）、1,2,4-苯三酚乙酸酯（28）、（Z）-3-己烯基-3-硼酸儿茶酚酯（32）与丁香酚（33）等化合物购自阿拉丁试剂（上海）有限公司或上海泰坦科技股份有限公司。缩酮保护的L-DOPA与多巴胺衍生物，叔丁氧羰基（Boc）、9-芴基甲氧基羰基（Fmoc）、三甲基硅烷基（TMS）与叔丁基二苯基硅烷基（TBDPS）保护的儿茶酚等衍生物为实验室根据文献合成^{[13, 15-16]}。台式三用紫外线分析仪ZF-1，GF254型硅胶板购自青岛海洋化工有限公司。

配制120 mmol·L⁻¹苯酚水溶液（记为X）、20 mmol·L⁻¹ FeCl₃水溶液（记为Y）和pH调节溶液：1 mmol·L⁻¹与0.1 mmol·L⁻¹ HCl溶液、0.1 mmol·L⁻¹与0.01 mmol·L⁻¹ NaOH溶液。配制待测液：取一支15 mL的离心管，准确加入2.5 mL溶液X与2.5 mL溶液Y；另取一定量pH调节溶液，以蒸馏水调体积到3.0 mL；二者相混合，得一系列pH不同，但苯酚与FeCl₃浓度（37.5/6.25 mmol·L⁻¹）不变的待测液。采用类似方法，配制了2个系列的pH不同，但儿茶酚与FeCl₃浓度不变的待测液：0.75/0.25 mmol·L⁻¹（记为1倍浓度）和1.5/0.50 mmol·L⁻¹（记为2倍浓度）。不添加pH调节溶液，直接混合儿茶酚与FeCl₃的水溶液，配制了1、2、4、6、8、10和20.8倍浓度的儿茶酚-FeCl₃溶液。记录溶液颜色，然后，用分光光度计测量其在380～800 nm区域的吸收谱。

硅胶粉对显色反应的影响：取苯酚-FeCl₃（37.5/6.25 mmol·L⁻¹, pH 2.38, a）、儿茶酚-FeCl₃（0.75/0.25 mmol·L⁻¹，pH 4.85, b）与（0.75/0.25 mmol·L⁻¹, pH 6.15, c）3种溶液和蒸馏水（对照），添加GF254硅胶粉（0.1 g·mL⁻¹），涡旋5 min后离心，观察颜色并测量水相pH。

配制金属氯化物检测液：称取六水合三氯化铁（1.62 g，6 mmol·L⁻¹ ）溶于100 mL乙醇中，得60 mmol·L⁻¹ FeCl₃检测液；采用类似方法，分别制得FeCl₂、CuCl₂和AlCl₃检测液，浓度均为60 mmol·L⁻¹。

配制六浓度梯度酚类样品液：称取待测酚类化合物，溶于合适溶剂中，得样品液A（50 mmol·L⁻¹）；取0.50 mL样品液A，添加1.00 mL溶剂稀释，得样品液B（17 mmol·L⁻¹）；采用类似方法，制得浓度等比递减（公比1/3）的样品液C（5.6 mmol·L⁻¹）、D（1.8 mmol·L⁻¹）和E（0.62 mmol·L⁻¹）；以纯溶剂为对照液F（0 mmol·L⁻¹）。

制备6浓度梯度样品点：采用模板在TLC GF254硅胶板上画6个大小一样的圆（直径3.9 mm，面积12 mm²），从左至右依次记为A至F。用毛细管（内径0.3 mm）移取0.7 µL样品液A（液柱高10 mm）点在A圆内，形成样品点A（单位面积载样量0.002 9 mol/m²）；采用类似方法，吸取等量样品液B、C、D、E和对照液F，制得载样量等比递减的样品点B、C、D、E和对照点F。

TLC硅胶板上的显色方法：用喷瓶均匀喷FeCl₃检测液到TLC板上，室温晾干，观察显色情况并拍照；如需烤板，将上述TLC板放入110 ℃烘箱中加热5 min。采用类似方法测试酚类物质与FeCl₂、CuCl₂和AlCl₃的颜色反应。鉴别4种酚类化合物的方法：以50 mmol·L⁻¹酚类样品液在TLC板上点样，在二氯甲烷（DCM）/甲醇（5%）混合液中展开，依次采用紫外光（254 nm）照、室温下喷FeCl₃和110 ℃烤板5 min的方式进行检测。

取50 mL单口烧瓶，加入六水合三氯化铁（0.16 g，0.60 mmol·L⁻¹ ）、9.50 mL无水乙醇与0.50 mL蒸馏水；在油浴中预热到设定温度（50、60或70 ℃）后，加入缩丙酮化合物10（0.20 g），搅拌并计时。每隔约20 min取1.00 mL混合溶液，快速冷却终止反应；旋蒸去除溶剂，加水与DCM各5.0 mL并振荡；取有机相3.0 mL，用无水Na₂SO₄干燥；取1.00 mL上层清液，去除溶剂后，加1.00 mL乙腈提取；采用HPLC分析化合物10的剩余量，以准一级降解动力学曲线对其峰面积进行拟合。

苯酚-FeCl₃（37.5/6.25 mmol·L⁻¹）水溶液在pH 1.78～2.41间显紫色（图2-i，表1-i）；pH降低时，混合液颜色极淡；pH升高时，显棕色。儿茶酚与FeCl₃的1倍浓度水溶液（图2-ii，表1-ii）在pH 4.00～5.53间显青色，在pH 6.15～ 8.99间显蓝黑色；2倍浓度水溶液在更低的pH即可显色（图2-iii，表1-iii），在pH 3.2时显青色，在pH 5.52显蓝黑色；在相同pH时，2倍浓度的颜色比1倍浓度的深很多。等比升高儿茶酚与FeCl₃的浓度对混合液的pH与颜色有显著影响（图2-iv，表1-iv）：浓度升高，混合液pH降低，颜色加深。添加硅胶粉严重影响酚类与FeCl₃在水中的显色反应：测试的a、b、c 3种溶液的颜色都消失了；经测量上层清液的pH值向对照液的pH（5.9）偏移。

在pH 4.85时，儿茶酚与FeCl₃的1倍浓度水溶液在434 nm与719 nm处有吸收峰，表明主产物为单儿茶酚配位络合物（mono-coordinated complex, MCC）（图3-i）；当pH提高到6.15时，吸收谱在583 nm出现了新吸收峰，表明主产物为双儿茶酚配位络合物（bi-coordinated complex, BCC）。在相同pH下，2倍浓度溶液的吸光度比1倍浓度的大很多，如在pH 4.9，2倍浓度溶液在719 nm处的吸光度约是1倍浓度的3倍（图3-ii）；当pH提高到10.38时，2倍浓度溶液的吸收谱在471 nm出现了新吸收峰，表明产生了三儿茶酚配位络合物（tri-coordinated complex, TCC）。

未保护的酚类物质与FeCl₃在TLC硅胶板上的显色结果很不相同。苯酚、对苯二酚与间苯二酚的点样点均为无色，喷FeCl₃检测液并晾干后，转为淡黄色，与背景色一致（图4-i）；儿茶酚与连苯三酚样品点在喷FeCl₃后立刻呈青黑色，室温下晾干转为蓝黑色。水杨酸17、丹皮酚19和麦芽酚20在TLC板上的点样点为无色（图4-ii），喷FeCl₃后显紫红色（图4-iii）；桑黄素21为黄色粉末，点样点也为黄色，在室温下喷FeCl₃后转为棕黑色。

3种酚类化合物与FeCl₃、FeCl₂、CuCl₂和AlCl₃在TLC板上的显色结果：苯酚在110 ℃或室温与4种氯化物都不显色（图4-iv～图4-vii）。儿茶酚在室温与Fe²⁺显浅灰色，与Cu²⁺显棕黑色，与Al³⁺不显色。缩丙酮9在室温与4种金属氯化物都不显色，但在110 ℃烤板5 min后，显色结果不同：喷过FeCl₃或FeCl₂的，显蓝黑色；喷过CuCl₂或AlCl₃的，不显色；先喷AlCl₃，接着烤板（110 ℃），再加喷FeCl₃，样品点显蓝黑色（图4-vii，末尾TLC板）。

保护的儿茶酚衍生物与FeCl₃的颜色反应可分成三类（图4-viii～图4-ix）：（1）在室温不显色，在110℃烤板5 min后显蓝黑色，如缩丙酮保护的多巴胺与多巴衍生物10、13、14和16，Boc保护的多巴胺23；当检测分子量较大结构较复杂的儿茶酚衍生物时，如三肽15，显色反应变得困难，在110 ℃时显色很淡，升温至140 ℃，才显较深颜色；（2）在室温与在110 ℃烤板5 min的条件下都不显色，如亚甲基缩醛（缩甲醛）保护的儿茶酚11与12，Fmoc保护的儿茶酚22，TBDPS保护的多巴胺25，甲醚保护的多巴胺26与邻苯三酚27，乙酰基（Ac）保护的28，特戊酰基（Piv）保护的29和苯甲酰基（Bz）保护的30；（3）在室温晾板过程中逐渐显蓝黑色，如TMS保护的儿茶酚24，硼酸酯保护的儿茶酚31与32。单保护的丁香酚33和乙酰水杨酸18在室温下不显色，在110 ℃时仅高浓度样品点显色。

显色深浅与样品浓度的关系：儿茶酚在浓度为50 mmol·L⁻¹时（A点）显色非常深；降至17 mmol·L⁻¹时（B点），显色适中；降至5.6 mmol·L⁻¹时（C点），颜色较淡；降至1.8 mmol·L⁻¹时（D点），颜色极淡，难以观察；低至0.62 mmol·L⁻¹时（E点），不显色。保护的儿茶酚显示的颜色比同浓度未保护的略浅，例如10和23，在5.6 mmol·L⁻¹时（C点）显色非常淡，不方便观察。

酚类化合物2、5、10与25的简单区分实验结果（图4-x）：紫外光照下，4种酚类物质都显黑色；喷FeCl₃后，儿茶酚样品点呈蓝黑色而苯酚不显色；在110 ℃烤板5 min后，缩丙酮保护的儿茶酚10转为蓝黑色而TBDPS保护的儿茶酚25依旧不显色。

在室温，未观测到缩丙酮化合物10在稀FeCl₃乙醇溶液（60 mmol·L⁻¹）中发生分解；当温度升高到50 ℃时，检测到缩丙酮发生了显著分解。采用一级降解曲线拟合缩丙酮化合物10的剩余量（HPLC峰面积）与时间（min）的关系（R² > 0.99）并经计算得到：在50、60和70 ℃，缩丙酮10的分解半衰期分别为266（图5-i）、93.8（图5-ii）和78.8 min；当分解温度接近乙醇沸点时，溶剂挥发严重，剩余缩丙酮10的测量值偏高，导致半衰期计算值偏大。

酚类与FeCl₃在水溶液中的显色反应是一种可逆络合反应,受到酚类络合能力、浓度与溶液pH的影响。苯酚与FeCl₃需在较高浓度（37.5 mmol·L⁻¹）与较窄的pH范围才能显示清晰的紫色；儿茶酚在低浓度（0.75 mmol·L⁻¹，苯酚的1/50）即能显示清晰的颜色，具体颜色与主要络合产物存在形式有关并受到pH与溶液浓度的影响：在低pH主要以MCC与BCC形式存在，显青黑色或蓝黑色；在高pH（>9）以TCC形式存在，显棕红色^[17-20]；同比增加儿茶酚与FeCl₃浓度可以促进多配位络合物的生成。

GF254硅胶表面与孔隙中有大量的硅羟基与平衡离子，具有一定的pH（本实验采用的硅胶板5.9）缓冲能力；硅胶的硅羟基对Fe³⁺有络合作用，其生成常数LogK应接近于原硅酸的8.9（表2）；随着溶剂的挥发，硅胶上加载的样品液被逐渐浓缩并被吸附到硅胶表面。实验发现，往苯酚或儿茶酚与FeCl₃的水溶液中添加少量硅胶粉，溶液的颜色消失；这证明硅胶对酚类的显色反应有显著性影响。因此，与水溶液中的显色反应不同，酚类与FeCl₃在TLC板上的颜色反应受到硅胶特殊理化性质的影响：一个弱酸性的pH缓冲环境、一个硅羟基参与的竞争络合环境和一个样品液被浓缩的吸附环境。

苯酚对Fe³⁺的络合能力只有硅羟基的1/10（表2）并且苯酚点样液被限制在较低浓度，因此在大量硅羟基存在下，苯酚不能有效结合Fe³⁺并形成紫色的六配位络合物；另外，苯酚载样量很少，不足以改变硅胶板的低pH大环境，因此苯酚与FeCl₃在TLC板上不显色。其他只含孤立酚羟基的化合物，如对苯二酚和邻苯二酚它们对Fe³⁺的络合能力与苯酚相似，在TLC板上也不显色。

儿茶酚对Fe³⁺的络合能力是硅羟基的一千亿倍（表2），远高于大多数配体^[22]，因此儿茶酚不受硅羟基竞争络合的影响。喷FeCl₃后，儿茶酚样品点显青黑色，表明主要络合产物为MCC；晾干后，转为蓝黑色，表明生成了较多的BCC。三配位络合物TCC颜色偏棕红，其形成所需的pH与配体浓度都很高。因此，儿茶酚显示的颜色主要来源于MCC和BC而与TCC无关。同样原因，其他络合能力强的螯合型配体，如邻苯三酚6和水杨酸17（表2），也能与FeCl₃在硅胶板上发生显色反应。在测试的4种金属离子中，Fe³⁺与儿茶酚的络合能力最强，受硅羟基的干扰最小；生成的络合物呈现特征性蓝黑色，方便判断；FeCl₃是一种较强的路易斯酸，可以选择性分解对酸不稳定的保护基；因此，FeCl₃成为在TLC硅胶板上通过颜色反应来区分儿茶酚保护基类型的最佳试剂。

保护的儿茶酚类化合物由于不能与Fe³⁺形成络合物，因此在硅胶板上不与FeCl₃发生颜色反应。以缩丙酮保护的多巴胺10和Boc保护的多巴胺23为例，二者的样品点从A到E在室温下喷FeCl₃检测液后都不显色。在110℃烤板5 min后，样品10与23的A与B点显示清晰的蓝黑色，与儿茶酚在晾干的硅胶板上显示的颜色一致，只是略淡，暗示样品10与23的A与B点可能含有BCC型络合产物。

缩丙酮10在FeCl₃乙醇溶液中的分解实验揭示了上述显色反应的化学机制。在室温，缩丙酮基本不被稀FeCl₃溶液分解，而保护状态的儿茶酚不能与Fe³⁺形成有颜色的络合物，因此样品点不显色；随着温度升高，缩丙酮分解加快，在60℃时半衰期只有93.8 min，在110 ℃时，其分解半衰期应更短；烤板5 min后，样品点内应已生成大量脱保护的儿茶酚基，后者与Fe³⁺络合形成了BCC型产物，所以显蓝黑色。由于总有部分缩丙酮未被分解，因此缩丙酮样品点的颜色，比同浓度的儿茶酚样品点的颜色，略淡一些。酚类浓度梯度与显色深浅的关系表明：儿茶酚在50 mmol·L⁻¹时显色已很深，继续增加浓度会引起样品过载或改变硅胶限定的反应条件；另外，虽然儿茶酚在5.6 mmol·L⁻¹时的显色可辨，但保护的儿茶酚在该浓度显色较淡，而在17 mmol·L⁻¹时显色明显；综合考虑，最佳酚类检测浓度范围介于10至50 mmol·L⁻¹。

缩甲醛、Fmoc、TBDPS、甲基（醚）、Piv或Bz等对强酸稳定的保护基，在室温和110 ℃烤板5 min条件下，不被FeCl₃分解或分解极少，因此这些保护基保护的儿茶酚衍生物在TLC硅胶板上不显色。TMS和硼酸酯等对酸非常敏感的保护基，在室温即可被稀FeCl₃溶液脱保护，引起自由儿茶酚基的含量逐渐升高，因此不需要烤板，在TLC板晾干过程中即渐渐呈现蓝黑色。另外，只有一个酚羟基被保护的儿茶酚，如丁香酚33，邻位自由羟基可以促进FeCl₃对单保护基的分解，导致单保护酚类化合物的稳定性比全保护的差；在烤板条件下，丁香酚高浓度样品点可以产生足够多的自由儿茶酚基，从而与Fe³⁺络合并显色。对乙酰水杨酸18，由于邻位活泼羧基的影响，也具有类似丁香酚的显色现象。

综上所述，TLC硅胶板提供了一个与水相不同的特殊反应环境，由于儿茶酚等螯合型配体对Fe³⁺的络合能力远大于硅羟基与单酚羟基的，因此在硅胶板上苯酚等含孤立酚羟基的化合物不能与FeCl₃ 发生颜色反应，而儿茶酚等络合能力强的化合物则可以；儿茶酚与FeCl₃显示的颜色来自一配位和二配位络合物，与三配位络合物无关。保护的儿茶酚不能直接与FeCl₃络合而在硅胶板上显色，但是对酸不稳定型保护基保护的儿茶酚，因FeCl₃检测液同时具有选择性脱保护的特性，在室温或烤板条件下，也能发生颜色反应；对强酸稳定型保护基保护的儿茶酚，两种条件下都不显色。本研究开发的在TLC硅胶板上的颜色反应能够快速、准确地检测出保护的与未保护的儿茶酚类物质，可用于监控儿茶酚类化合物的反应进程，特别是L-DOPA的衍生物，促进多酚类天然产物、抗帕金森病前药与功能材料等研究领域的发展。